[发明专利]一种潜隐病毒基因组的提取方法

权利要求书

1.一种潜隐病毒基因组的提取方法，其特征在于，包括：

步骤一、样品预处理

采集感染潜隐病毒的桑树叶片，冷冻7-15天，然后将桑树叶片与PBS缓冲液按照1g :5-15mL混合研磨成浆，获得样品溶液；

步骤二、病毒的浓缩

样品溶液经3000-10000r离心，去除沉淀，取上清得病毒提取液；

步骤三、磁珠活化

将待活化的磁珠液置于磁力架2-3min，除去上清；所得沉淀依次经pH 8.0、pH 7.6、pH7.2、pH 7.2且含0.25-0.35mM氯化钠的PBS缓冲液活化，最后除去上清，获得活化磁珠；

步骤四、磁珠和病毒提取液的结合

所述磁珠为PEG2000磁珠；

将活化磁珠与病毒提取液混合，震荡孵育，磁力架吸附后去除上清；向沉淀中加入pH7.2且含0.25-0.35mM氯化钠PBS缓冲液，混匀后置于磁力架2-3min，除去上清，最终收集的沉淀为磁珠-病毒复合物；

步骤五、潜隐病毒基因组的洗脱

向磁珠-病毒复合物中加入缓冲液E，置于70℃水浴5min，然后置于磁力架吸附5min，吸取上清到一个新的离心管中，加入上清2-3倍体积的异丙醇和10-20μL 5M氯化钠溶液，冷冻1h后4℃、14000r离心10min，沉淀用体积分数70-75%的乙醇溶液洗涤，最后用100μL的无酶水溶解，获得病毒洗脱液；

步骤六、DNA酶消化

利用DNASE酶 I消化步骤五的病毒洗脱液，并用70℃灭活DNASE酶 I；加入相当于消化液2-3倍体积的异丙醇和10-20μL 5M氯化钠溶液，冷冻1h后4℃、14000r离心10min，沉淀用体积分数70-75%的乙醇洗涤，最后用50μL的无酶水溶解，获得潜隐病毒基因组。

2.根据权利要求1所述的潜隐病毒基因组的提取方法，其特征在于，步骤一中，冷冻的温度为-28 ~ -18℃。

3.根据权利要求2所述的潜隐病毒基因组的提取方法，其特征在于，步骤一中，PBS缓冲液的浓度为0.1M、pH 为7.2。

4.根据权利要求1所述的潜隐病毒基因组的提取方法，其特征在于，步骤三中PBS缓冲液活化的具体步骤为：

向沉淀中加入pH 8.0 PBS缓冲液，混匀后置于磁力架2-3min，除去上清；向沉淀中加入pH 7.6 PBS缓冲液，混匀后置于磁力架2-3min，除去上清；向沉淀中加入pH 7.2 PBS缓冲液，混匀后置于磁力架2-3min，除去上清；向沉淀中加入pH 7.2含0.25-0.35mM氯化钠的PBS缓冲液，混匀后置于磁力架2-3min，除去上清，获得活化磁珠，备用。

5.根据权利要求1所述的潜隐病毒基因组的提取方法，其特征在于，步骤五中，缓冲液E的组成为：5mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，1mL/1000mL 1-巯基甘油，1g/100mL SDS，溶剂为ddH₂O，pH 8.5。

6.根据权利要求1所述的潜隐病毒基因组的提取方法，其特征在于，还包括PCR检测步骤：

对步骤六所得潜隐病毒基因组进行反转录，然后利用PARTF668/ PARTR975对反转录产物进行PCR检测，随机引物序列为5’-NNNNNN-3’；

PARTF668：5’-ACATCGTCTTGGCGATCCTAA-3’

PARTR975：5’-TCTGTATTCGGCAGAACCGTAA-3’。

7.根据权利要求1所述的潜隐病毒基因组的提取方法，其特征在于，还包括定量PCR步骤：

定量PCR引物如下：

YJH CV1 F：5’-GAGTACGAACACACTTGGCC-3’

YJH CV1 R：5’-AGTCTTGGTGTGCAGGGAAT-3’。