[发明专利]逆转录病毒载体、应用及CAR-T细胞杀伤功能评估方法

说明书

本发明公开了一种逆转录病毒载体、应用及CAR‑T细胞杀伤功能评估方法，逆转录病毒载体包含编码IFN‑γ启动子和荧光蛋白基因的序列，所述荧光蛋白基因受所述IFN‑γ启动子的转录控制；CAR‑T细胞杀伤评估方法包括如下步骤：利用逆转录病毒载体感染CAR‑T细胞；将CAR‑T细胞与靶细胞共培养；取共培养后的细胞进行流式细胞分析，检测荧光蛋白基因表达情况。本发明逆转录病毒载体感染宿主CAR‑T细胞后，逆转录IFN‑γ启动子序列和荧光蛋白基因；宿主CAR‑T细胞受到靶细胞刺激时，激活IFN‑γ启动子序列，开始荧光蛋白基因和IFN‑γ基因的表达，通过检测荧光蛋白基因的表达情况能够分析IFN‑γ即γ干扰素的分泌情况；实现快速方便的CAR‑T杀伤功能评估方法，普及性强。

技术领域

本发明涉及CAR-T免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种逆转录病毒载体和应用以及CAR-T细胞放行检测方法。

背景技术

随着CAR(chimeric antigen receptor)技术的发展，正成为肿瘤免疫治疗的新星技术手段。慢病毒或逆转录病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。目前慢病毒载体与逆转录病毒载体被广泛用于CAR-T免疫细胞治疗领域。

在CAR-T研究中，常常需要对某种CAR-T进行体外细胞水平和体内小鼠肿瘤模型的功能验证。对CAR-T杀伤功能评估的重要指标之一就是IFN-γ的分泌水平；同时在临床研究中，由于在靶细胞刺激下会促进CAR-T细胞分泌IFN-γ，因此通常CAR-T产品的放行指标之一就是肿瘤抗原刺激下IFN-γ的分泌水平。

目前通常使用Elisa试剂盒进行细胞因子的检测，但是Elisa检测耗费时间长，成本高，操作也较繁琐，不利于CAR-T细胞的快速放行检测。

因此急需一种快速方便的检测受肿瘤抗原刺激后CAR-T细胞分泌IFN-γ情况的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种逆转录病毒载体和应用以及CAR-T细胞放行检测方法，以解决现有技术中采用Elisa试剂盒进行细胞因子的检测，检测耗费时间长，成本高，操作也较繁琐，不利于CAR-T细胞的快速放行检测的技术问题。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

本发明第一方面公开了一种逆转录病毒载体，包含编码IFN-γ启动子和荧光蛋白基因的序列，所述荧光蛋白基因受所述IFN-γ启动子的转录控制。

通过采用上述方案，本发明的逆转录病毒载体感染宿主CAR-T细胞后，能够逆转录IFN-γ启动子序列和荧光蛋白基因；当宿主CAR-T细胞受到靶细胞刺激时，会同时激活逆转录的IFN-γ启动子序列以及宿主DNA中的IFN-γ启动子序列，从而开始荧光蛋白基因和IFN-γ基因的表达，通过检测荧光蛋白基因的表达情况能够分析IFN-γ即γ干扰素的分泌情况，从而对CAR-T杀伤功能进行评估。

在本发明的某一个实施例中，所述IFN-γ启动子序列为SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示序列中的一种。

在本发明的某一个实施例中，所述荧光蛋白基因为GFP、EGFP、RFP、mcherry中的一种或多种组合。

在本发明的某一个实施例中，所述逆转录病毒载体不包含增强子。

通过采用上述方案，避免增强子增强荧光蛋白基因表达，从而影响对于荧光蛋白基因的表达情况与IFN-γ基因表达情况的相关性，影响分析结果。

在本发明的某一个实施例中，所述逆转录病毒为慢病毒。

本发明第二方面公开了包括上述逆转录病毒载体的CAR-T细胞。