[发明专利]基于碳原子的罗丹明衍生物骨架的溶酶体靶向染色试剂及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于碳原子的罗丹明衍生物骨架的溶酶体靶向染色试剂及其制备方法和应用，本发明以碳原子取代的氨基罗丹明衍生物骨架作为溶酶体染料的基础，通过合理的不同形式的芳香胺的调控设计，得到了基于碳原子罗丹明衍生物骨架的不同发射波长的溶酶体靶向染色试剂，该类试剂在快速靶向染色的同时，能够实现超低浓度的靶向成像，有较高的生物相容性，不会对活细胞的生理活动产生干扰。此外，由于该染色试剂具有超大斯托克斯位移的特性，在进行生物成像时，基本不会受到激发光的散射光所造成的成像干扰，使得该类染料还具有高信噪比成像的特异表现。本发明的制备方法收率高、反应条件温和，制得的染色试剂斯托克斯位移大、靶向性高。

技术领域

本发明涉及生物化学领域，尤其涉及溶酶体靶向染色技术领域，具体涉及一种基于碳原子的罗丹明衍生物骨架的溶酶体靶向染色试剂及其制备方法和应用。

背景技术

溶酶体是分解蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的细胞器。溶酶体具单层膜，形状多种多样，是0.025～0.8微米的泡状结构，内含许多水解酶，溶酶体在细胞中的功能，是分解从外界进入到细胞内的物质，也可消化细胞自身的局部细胞质或细胞器。

溶酶体作为细胞内的“消化站”，可以降解各种内源和外源性的生物大分子，溶酶体内酸性的微环境(pH 4.5-5.5)能够保证水解酶的活性，使得细胞内消化和降解的过程可以顺利进行。在新陈代谢的过程中，溶酶体膜的通透性改变会刺激细胞产生诱导细胞内源性死亡的物质和活性氧簇，同时将水解酶释放到细胞质中，最终使细胞开始凋亡。溶酶体，它也是细胞内吞过程的“终点站”，与细胞死亡的三个通路：细胞凋亡(Apoptosis)、II型细胞程序化死亡(Type II Programmed cell death)和细胞坏死(Necrosis)都有一定程度的关联。

因此，开发高选择性、高灵敏度的溶酶体染色技术以准确对活细胞内溶酶体进行实时成像，对于探索与解决溶酶体相关生物医学基本问题具有非常深远的意义。

现有的市售溶酶体染色染料通常为基于氟硼二吡咯结构的荧光染料，该类荧光染料光稳定性较差，同时活细胞内的谷胱甘肽等还原性生物硫醇容易造成干扰，染料的斯托克斯位移太小，成像信噪比不高，成像所需浓度较高以及时间较长，有许多的缺陷限制了其进一步应用。因此，开发一种具有大斯托克斯位移的，光稳定性优异，超快速超低浓度溶酶体靶向荧光染料具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于碳原子的罗丹明衍生物骨架的溶酶体靶向染色试剂，以解决现有溶酶体靶向染料因需要斯托克斯位移小，成像浓度高，成像时间长而导致的操作过程复杂、耗时长、成像结果准确性低的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

基于碳原子的罗丹明衍生物骨架的溶酶体靶向染色试剂，具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示结构：

其中，R₁为C1-C10烷基链或芳香基团。

在本发明较佳的实施例中，上述R₁为丙基、苯基、萘基或吡啶基。

在本发明较佳的实施例中，上述溶酶体靶向染色试剂为：

制备具有式(Ⅰ)的基于碳原子的罗丹明衍生物骨架的溶酶体靶向染色试剂的方法，包括以下步骤：

(1.1)将间溴苯胺和1，4-二溴丁烷溶于第一有机溶剂中并加入第一弱碱加热搅拌，反应得到中间体A1；

(1.2)在惰性气氛下将所述中间体A1加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，然后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A2；