[发明专利]一种复合酶催化纤维素制备低聚龙胆糖的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种复合酶催化纤维素制备低聚龙胆糖的方法及其应用，属于酶工程技术领域。本发明在Thermotoga sp.KOL6来源的β‑葡萄糖苷酶基础上，通过定点突变的方式获得突变体，以巴斯德毕赤酵母KM71为表达宿主，实现突变体基因在毕赤酵母中的高效表达。同时，本发明的复合酶可有效转化纤维素生成低聚龙胆糖；以磷酸膨胀纤维素和葡萄糖为底物酶催化转化制备低聚龙胆糖，复配纤维素酶和β‑葡萄糖苷酶突变体Q34G/Y200F时，原料的总转化率19.1％，相比野生型β‑葡萄糖苷酶分别提高74.7％。本发明的技术方案具有很高的工业应用价值。

技术领域

本发明涉及一种复合酶催化纤维素制备低聚龙胆糖的方法及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

低聚龙胆糖是葡萄糖以β-1,6糖苷键连接形成的低聚寡糖，主要成分是龙胆二糖，并含有少量的龙胆三糖和龙胆四糖，是一种新型功能性低聚糖。低聚龙胆糖具有极好的益肠道功效，与低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚半乳糖等功能性低聚糖相比，低聚龙胆糖具有低粘度、持水性好、对pH和热非常稳定等特点，可应用于一些其他低聚糖不耐受的食品中；且具备独特的提神苦味，可增加食品口味的丰富性。目前低聚龙胆糖在大众极为喜爱的食品中已有较为广泛的应用，是极具开发前景的高附加值糖类产品。

至今国内外仍仅有日本食品化工株式会社生产该产品(商品名Gentose#45、Gentose#80)，且产量不高，仅350吨，市场缺口较大。随着市场需求的扩大，酶法制备制备低聚龙胆糖具有反应条件温和、菌种安全、污染性小、成本低廉、易于分离等优点，开始受到国内外研究人员的关注，是目前生产低聚龙胆糖的主要发展趋势，但目前未有较为理想的案例报道。早期研究者利用β-葡萄糖苷酶催化逆水解缩合反应以高浓度葡萄糖或酸水解淀粉所得的葡萄糖浆为底物制备低聚龙胆糖，在200-900g/L葡萄糖底物浓度下，转化率大致分布于5-15％之间。近年来逐渐出现了利用β-葡萄糖苷酶转糖苷反应以纤维二糖为底物生产低聚龙胆糖的研究，相比目前以高浓度葡萄糖为底物的反应体系，这种转苷反应体系在催化效率和转化率上均具有明显优势，转化率约为19.6％，但底物纤维二糖成本昂贵，不适合大规模生产；如何开发得到一种能够有效利用廉价底物且可高效制备低聚龙胆糖的方法，成为迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明建立了一种复合酶催化纤维素转化制备低聚龙胆糖的反应体系，在一定浓度葡萄糖抑制β-葡萄糖苷酶水解活性的条件下，利用高转糖苷活性β-葡萄糖苷酶取代传统纤维素降解酶体系中的高水解活性β-葡萄糖苷酶，可将纤维二糖转化为低聚龙胆糖，消除纤维二糖的产物抑制；上游纤维素酶对纤维素的水解又可填补纤维二糖的消耗。通过协同反应体系的调控，可实现高效低聚龙胆糖制备。

本发明首先提供了一种β-葡萄糖苷酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第34位和/或第200位突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶突变体为：将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第34位由谷氨酰胺突变为甘氨酸得到的，命名为Q34G；

或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第34位由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸得到的，命名为Q34M；

或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第200位由酪氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为Y200F；

或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第34位由谷氨酰胺突变为甘氨酸，同时将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第200位由酪氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为Q34G/Y200F。