[发明专利]一种双基因修饰的干细胞及其用途

权利要求书

1.一种双基因修饰的干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1，获得第一外源核酸和第二外源核酸，酶切后与载体质粒pCDH-EF1连接，得到重组质粒pCDH-AQS，其结构如附图图1所示；

所述第一外源核酸为脂联素基因，第一外源核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

第二外源核酸为突变的鞘氨醇激酶1基因，所述突变的鞘氨醇激酶1基因为将其GKGK结构域中的两个K分别突变为精氨酸或谷氨酰胺，第二外源核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述第一外源核酸和第二外源核酸包含于相同的表达载体中；

所述第一外源核酸和第二外源核酸通过编码自我切割肽的序列连接，所述编码自我切割肽的序列如SEQ ID NO:6所示；

所述连接后的第一外源核酸和第二外源核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述连接后的第一外源核酸和第二外源核酸编码如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的蛋白；

步骤2，将重组质粒与包装质粒进行慢病毒包装细胞的转染，得到含有第一外源核酸和第二外源核酸的重组慢病毒载体；

步骤2包括以下子步骤：

步骤2-1，培养包装细胞；所述包装细胞为293T细胞；

步骤2-2，转染包装细胞；

将包装质粒与步骤1获得的重组质粒pCDH-AQS混合，温育后加入转染试剂，室温孵育，形成DNA-脂质体转染复合物；将DNA-脂质体转染复合物与包装细胞混合均匀，培养，获得重组慢病毒载体；

所述包装质粒为Helper1质粒、Helper2质粒和Helpher3质粒，重组质粒、Helper1质粒、Helper2质粒和Helpher3质粒的质量比为2:1:1:1；

步骤3，将上述获得的重组慢病毒载体转染至间充质干细胞，得到双基因修饰的干细胞；

所述间充质干细胞来源于脐带。

2.一种权利要求1所述的方法制备的双基因修饰的干细胞在制备治疗代谢疾病药物中的应用，所述代谢疾病选自肥胖、II型糖尿病、血脂异常、胰岛素耐受和动脉粥样硬化。