[发明专利]一种新型冠状病毒抑制剂筛选的方法

说明书

本发明提供一种新型冠状病毒抑制剂筛选的方法，属于生物分析检测领域。该方法通过荧光成像，采集活细胞内变化的荧光信号实现抑制剂的筛选。具体的方法是，首先通过基因工程方法分别在新型冠状病毒的受体结合蛋白(RBD)及其受体人源血管紧张素转化酶2(hACE2)融合上标签蛋白，小分子荧光探针能够专一的标记这两个蛋白。在细胞内过表达hACE2融合蛋白并荧光标记，荧光标记的RBD蛋白能够专一的识别活细胞内hACE2蛋白，在荧光显微镜下呈现叠加的荧光信号。以hACE2的荧光信号作为参比，当抑制剂分子与荧光标记的RBD蛋白共孵育时，RBD荧光信号减弱，从而筛选出新冠病毒抑制剂，并且能够检测抑制效率。该方法具有灵敏、快速的特点，能够在活细胞内实时筛选新冠病毒抑制剂。

技术领域

本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种新型冠状病毒抑制剂筛选的 方法。

背景技术

目前还没有治疗新冠病毒的特效药物，因此药物发现与筛选工作成为部分 研究人员关注的重点。

冠状病毒是由核壳蛋白包裹单链RNA组成，COVID-19感染细胞的机制与 SARS-CoV相似，都是通过病毒表面的刺突S蛋白与人细胞膜蛋白血管紧张素 转化酶2(hACE2)结合，在蛋白酶的作用下，内呑进入细胞内，然后释放RNA 感染。COVID-19的S蛋白与SARS-CoV的S蛋白有近80％的同源性，都是由 S1和S2两个亚基组成，其中，S2亚基包含疏水单元，用于侵染细胞膜。而S1 亚基包含一个受体结合部位RBD(receptor-binding domain)，用于识别宿主细胞 的ACE2蛋白。研究显示hACE2与COVID-19的RBD-SD1蛋白的结合力是34.6 nM，为与SARS-CoV的RBD-SD1蛋白(K_D＝325.8nM)结合力的近10倍，这 解释了COVID-19的感染性更强的原因。

由于RBD与hACE2相互作用是病毒侵染细胞的关键，因此其活性中心部 位成为疫苗与药物开发的重要靶点，研究人员认为筛选出靶向hACE2-RBD作用 活性位点的药物，阻止病毒结合hACE2侵染细胞可能是其快速治疗方案。因此， 一种快速、高效、灵敏的筛选方法是必不可少的。目前，已经有大量研究者应 用计算机模拟的方法筛选hACE2或者RBD的抑制剂，但是计算机模拟法无法 还原蛋白的真实环境，误差较大；商业化的新冠病毒RBD抑制剂筛选试剂盒通 常是在体外环境利用ELISA方法检测，存在非原位，误差大，信号弱等缺点； 而应用假病毒原位侵染过表达hACE2细胞的方法则耗时长，无法通量的筛选。

荧光检测技术因具有原位检测、筛选通量高、检测成本低、检测仪器成熟 等突出优势，是药物筛选常用的手段。但是目前还没有荧光体系应用于 hACE2-RBD相互作用活性位点抑制剂的筛选。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的开发一种新型冠状病毒抑制剂筛选的 方法，该方法通过荧光成像，采集活细胞内变化的荧光信号实现抑制剂的筛选。 具体的方法是，首先通过基因工程方法分别在新型冠状病毒的RBD及其受体 hACE2融合上标签蛋白，使小分子荧光探针能够专一的标记这两个蛋白。然后 在细胞内过表达hACE2融合蛋白并荧光标记，荧光标记的RBD蛋白能够专一 的识别活细胞内hACE2蛋白，在荧光显微镜下呈现叠加的荧光信号。以hACE2 的荧光信号作为参比，当抑制剂分子与荧光标记的RBD蛋白共孵育时，RBD荧 光信号减弱，从而筛选出抑制剂分子，并且能够检测抑制效率。该方法具有灵 敏、快速的特点，能够在活细胞内实时筛选新冠病毒抑制剂

为实现上述目的，本发明提供一种新型冠状病毒抑制剂筛选的方法，该筛 选步骤为：

(1)在细胞内过表达标签蛋白-hACE2融合蛋白质粒。

(2)加入含上述标签蛋白专一底物的荧光探针，孵育10-30min，洗一遍；

(3)加入荧光标记的RBD-标签蛋白融合蛋白，或者抑制剂和荧光标记的RBD- 标签蛋白的混合物，孵育30-120min；