[发明专利]一种基于HSV-1的同源重组载体及其靶点序列和应用

说明书

一种基于HSV‑1的同源重组载体及其靶点序列和应用，为优化HSV‑1复制缺陷型中枢神经系统表达载体，本发明提供了一套完整的HSV‑1表达载体构建及筛选流程，可实现外源基因的高效插入及替换；同时，本发明筛选出了一种最佳的潜伏表达载体构建方法，即将完整外源基因表达框：cBh promoter‑repoter Gene‑bGH polyA插入至LAP启动子下游2.0 Kb Intron内的BstEII位点。该重组病毒能够实现报告基因在小鼠海马区长期高效的表达，并且兼具良好的安全特性。

技术领域

本发明涉及HSV-1中枢神经系统潜伏表达载体的构建策略及表达优化领域，特别涉及一种基于HSV-1的同源重组载体及其靶点序列和应用。

背景技术

HSV 1716 strain复制缺陷型载体具有较大容量，能够长期潜伏表达外源基因。HSV-1天然的视神经特性使其可在中枢神经系统中经突触顺行或逆行传播，并能够在神经元长期潜伏而不影响其正常功能，实现外源基因在中枢神经系统的高效、专一、长期表达。疫苗型HSV-1载体具有较高安全性。研究表明，改造型1716株由于γ34.5^-/-突变，使其在非癌细胞中缺乏复制能力，初次感染中枢神经系统即进入潜伏状态。

已有研究表明将外源基因编码区插入至复制缺陷型HSV-1载体LAP下游可实现中枢神经系统表达，但其表达量往往较低且迅速衰减。然而，随着越来越多的LAT基因座功能元件(维持LAP转录活性)被发现，外源基因插入的位置将显得尤为重要；另一方面，LAT下游区域的转录(包含病毒编码miRNA)改变也可能影响疫苗株的安全特性。因此本研究，通过进一步设计一系列HSV-1表达载体，比较其CNS潜伏表达活性和安全性，筛选最佳治疗载体。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供了一种基于HSV-1的同源重组载体及其靶点序列和应用，可实现外源基因的高效插入及替换，同时建立了一套准确快速的单克隆重组病毒筛选流程；此外，本发明筛选出了一种最佳的潜伏表达载体构建方法，即完整外源基因表达框插入至LAP启动子下游2.0Kb Intron内的BstEII位点。该重组病毒能够实现报告基因在小鼠海马区长期高效的表达，并且兼具良好的安全特性。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：一种HSV-1表达载体构建及筛选方法，运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将同源重组质粒及CRISPR-Cas9表达质粒同时转染至细胞，然后感染亲本病毒，以实现病毒基因组的插入及替换。同时，本发明设计了一列潜伏表达载体构建策略(不同插入位置及表达原件组成)，于体内体外模型筛选出了兼具安全性、表达量和持续时间的最佳潜伏表达载体。

一种基于HSV-1的同源重组载体，所述同源重组载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步的，所述载体具体为：HSV-11716株LMRx-α同源重组载体，该同源重组载体是将外源基因表达框cBh promoter-reporter gene-bGH poly插入至2.0Kb Intron内的BstEII位点得到。

一种基于上述同源重组载体的CRISPR-cas9靶点序列，所述靶点序列位于靶向LAP下游Exon1的第一个StyI位点：其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步的，所述靶点序列位于靶向LAP下游2.0Kb Intron内的BstEII位点：其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，所述靶点序列位于靶向cBhpromoter：其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步的，所述靶点序列位于靶向bGH polyA：其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

上述同源重组载体的PCR鉴定引物，所述引物序列如下：