[发明专利]一种干细胞冻存液及其制备和使用方法

说明书

本发明公开了一种干细胞冻存液及其制备和使用方法，该冻存液包括DMSO 0‑20％、甘油1‑2％、海藻糖1‑2％、乙醇2‑5％、N‑十二烷酰基肌氨酸0.05～0.07％、磷酸钙0.7～1.0％、猪苓酸C 0.03～0.06％、葫芦巴碱0.02～0.05％、1,8‑桉叶素0.01～0.04％、余量是DMEM培养基。使用本发明冻存液冻存后干细胞复苏率达到90％以上，增殖速度与未冻存细胞相比不仅无明显降低，甚至增殖速度加快。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种干细胞冻存液及其制备和使用方法。

背景技术

干细胞是一类具有高度自我更新增殖和多向分化潜能的细胞，包括神经干细胞、间充质干细胞等，其在一定的条件下可分化成多种类型的细胞。干细胞具有多种用途和功能，可用于体外研究组织器官的生长发育、建立疾病模型、药物筛选，也可用于疾病治疗。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

干细胞具有良好的临床应用前景，其长期安全稳定保存是一重要问题。低温冻存是实现干细胞长期保存的常用方法，但冷冻保存的过程的冰晶以及溶液效应等均对细胞产生一定的损伤。干细胞冻存液可保护细胞免受低温冻存中的冷冻损伤，能更好地保存细胞的生物性能。经典干细胞冻存液含有DMSO和胎牛血清，然而，DMSO虽可降低保存液的冰点并减少胞内冰的形成，但DMSO自身也具有一定的毒性，有研究也表明，高含量DMSO可能会改变染色体的稳定性，并导致细胞端粒长度的变化，反过来导致肿瘤的形成。胎牛血清可能含有动物源性病原体，也存在一定的安全问题。目前的干细胞冻存液的使用效果不甚理想，因此，研发一种有效防止细胞低温损伤和保持细胞活力的干细胞冻存液至关重要。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供一种干细胞冻存液及其制备和使用方法。

本发明方案包括以下方面：

一种干细胞冻存液，包括以下组份：按质量百分比，

DMSO 0～20％、甘油1～2％、海藻糖1～2％、乙醇2～5％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05～0.07％、磷酸钙0.7～1.0％、猪苓酸C 0.03～0.06％、葫芦巴碱0.02～0.05％、1,8-桉叶素0.01～0.04％、余量是DMEM培养基。

优选的，所述干细胞冻存液包括以下组份：按质量百分比，DMSO 0～5％、甘油1～2％、海藻糖1-2％、乙醇2～3％、N-十二烷酰基肌氨酸0.05～0.07％、磷酸钙0.7～1.0％、猪苓酸C0.03～0.04％、葫芦巴碱0.03～0.05％、1,8-桉叶素0.02～0.03％、余量是DMEM培养基。

更优选的，所述的干细胞冻存液包括以下组份：按质量百分比，DMSO 0％、甘油2％、海藻糖1％、乙醇3％、N-十二烷酰基肌氨酸0.06％、磷酸钙0.8％、猪苓酸C 0.04％、葫芦巴碱0.05％、1,8-桉叶素0.02％、余量是DMEM培养基。

本发明所述干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞。所述成体干细胞优选为脂肪间充质干细胞。

本发明还提供了所述的干细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：

将猪苓酸C与磷酸钙混合均匀，得混合物A；将N-十二烷酰基肌氨酸、葫芦巴碱、1,8-桉叶素与乙醇混合，20～25℃且100～150rpm搅拌条件下加入混合物A和/或DMSO，混合5～10min；依次加入甘油、海藻糖和DMEM培养基，混匀即得干细胞冻存液。

优选的，制备方法中，将猪苓酸C与磷酸钙混合，在30～35℃条件下均匀，保温备用。