[发明专利]马克斯克鲁维酵母工程菌株及其制备方法和生产乙醇的方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及马克斯克鲁维酵母工程菌株及其制备方法和生产乙醇的方法。该马克斯克鲁维酵母工程菌株为转入KmGCR1基因和KmGCR2基因的马克斯克鲁维酵母。与改造其他的转录因子相比，KmGcr1p、KmGcr2p更加具有全局性，不仅可以促进糖酵解过程，还可以提高菊粉酶活力以提高底物利用率、加快生长速率以缩短生产周期、维持细胞的高耐热性以减少生产成本和发酵罐使用的地域限制和季节限制、增加发酵过程中抗逆物质的产量以抵御不良环境。超表达KmGCR1和KmGCR2基因是得到在40℃以上利用非粮食作物高产乙醇的马克斯克鲁维酵母的可选策略。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及马克斯克鲁维酵母工程菌株及其制备方法和生产乙醇的方法。

背景技术

随着人们生活水平的逐渐提高，化石燃料的使用量也逐渐增加，导致了全球变暖和世界性的环境污染问题，这促使我们找到一种环境友好型的可持续生物燃料来代替化石燃料。生物乙醇就是一种使用最为广泛的生物燃料，它是通过微生物的发酵过程将各种生物质转化为燃料乙醇。生物乙醇与汽油相比，具有更高的辛烷值、更宽的可燃性极限和更高的汽化热；与石油相比，生物乙醇的毒性更小、产生的环境污染更少。酵母在生物乙醇的发酵中起十分重要的作用，它具有乙醇产量高、乙醇耐受性强、易于培养等特点。在诸多酵母中，酒精酵母具有乙醇产量高、耐受pH范围广、安全性强等特点，在几千年前就被选出应用于酿酒行业了，现在更是成为了生物乙醇制备的工业菌株。但是，与此同时它又有局限性。一方面，在乙醇发酵过程中，微生物大量代谢热的产生使整个发酵罐的温度达到40℃以上，而酒精酵母的最高生长温度为35℃。为了保证发酵过程的顺利进行，必须在发酵过程中通入大量冷凝水以降低发酵体系的温度。尤其是对于处于热带区域的国家而言，全年的高温更是大大提高了冷凝水带来的生产成本。酒精酵母这一局限性使得发酵罐运行受到了地域限制和季节限制。另一方面，酒精酵母多利用粮食作物为原料进行乙醇发酵，如甜高粱、玉米等。在全球人口日益增多的今天，必须对乙醇发酵的原料进行革新，否则只会加剧粮食紧缺的现象。

马克斯克鲁维酵母的耐高温能力很强，大部分可以在48℃的条件下生长，极个别种类的耐受温度可达52℃，在45℃的高温下仍可以产生乙醇。并且它的底物来源很广，既包括葡萄糖、果糖等常规碳源，还包括乳糖、木糖、菊粉等非常规碳源。但是马克斯克鲁维酵母的乙醇产量限制了其在高温乙醇发酵中的应用。所以筛选出可以在40℃以上利用非粮食作物高产乙醇的马克斯克鲁维酵母成为急需要解决的关键技术问题。

马克斯克鲁维酵母的耐高温能力很强，在45℃的高温下仍可以产生乙醇。它的底物来源很广，可以利用菊粉作为底物用于乙醇发酵。菊粉来源广泛、价格便宜，主要是从菊芋、菊苣等非粮食作物中提取的，它们的耐寒、耐旱能力强，可以在贫瘠的土地生长，也不会与粮食作物竞争耕种地。菊粉酶可以水解菊粉的β-2,1-果糖苷键，其水解产物果糖和葡萄糖可以直接通过糖酵解途径生成乙醇。菊粉酶主要来源于微生物，并且在真菌中，马克斯克鲁维酵母的菊粉酶活力是最高的。菊粉酶的最适作用温度为50—55℃，即使在温度超过40℃的发酵罐中仍可保持高活性。综上所述，以菊粉为底物，利用马克斯克鲁维酵母进行高温乙醇发酵是很有潜力的。Kanlayani筛选得到了一株耐热 K.marxianus Y-102，利用菊芋块茎在40℃下进行高温乙醇发酵，并对其碳源浓度和发酵pH进行优化，最终可以在总糖浓度230g/L，pH5.5~6.0的条件下产生85.41 g/L乙醇；Hu筛选得到了一株耐热 K.marxianus PT-1，以菊粉为底物在进行40℃在进行高温乙醇发酵。在菊粉浓度为100 g/L和200 g/L时的乙醇产量分别达到43g/L和69.6g/L。