[发明专利]一种基于适配体的抗生素双检测传感器的建立方法

说明书

一种基于适配体的抗生素双检测传感器的建立方法属于抗生素等物质检测领域。本发明建立一个可以同时检测两种抗生素即氯霉素和卡那霉素的适配体传感器，尽量降低实验成本，实现对抗生素残留的快速、高灵敏检测。本发明以氯霉素和卡那霉素适配体为例，借助一端修饰生物素的辅助短链以形成部分互补复合链结构固定在磁珠上，加入靶物质抗生素后通过抗生素与适配体之间的高亲和力将适配体从磁珠脱离至溶液中，利用实时荧光定量PCR方法实现对对应适配体的含量测定，建立一个抗生素共同检测的适配体生物检测器。本发明借助抗生素与适配体之间的高特异性亲和作用，通过q‑PCR方法定量分析竞争下来的游离适配体含量，从而分别得出两种抗生素的含量。

技术领域

本发明属于抗生素等物质检测领域，特别涉及到在基于适配体建立的生物传感器用于检测两种抗生素即氯霉素和卡那霉素的方法。目前利用适配体检测抗生素的传感器大多为单个靶物质检测。该方法可为双检测适配体传感器甚至多检测传感器的建立提供新思路。

背景技术

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一类广谱类抗生素，且效果十分显著、杀菌力极强。但是由于氯霉素用药有严重不良反应：抑制骨髓造血机能，引起再生障碍性贫血，目前联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家委员会建议禁止将氯霉素用于食用动物，中华人民共和国农业部公告第193号已将其列入《禁用清单》。由于其价格低廉、制备简单易得，为防止不法商家将其用做兽药对人体健康造成危害，对氯霉素进行高效且快速的检测方法的建立是一份十分迫切且重要的任务。卡那霉素(Kanamycin)是一种氨基糖苷类抗生素，主要用于需氧革兰氏阴性菌感染，如假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌。卡那霉素抗菌机理为：与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质的合成。但卡那霉素具有一定程度的肾脏毒性、神经毒性、耳毒性。抗生素传统检测的方法包括微生物检测、色谱检测和酶联免疫检测等，但这些检测方法都有一定缺陷，例如检测灵敏度低或者仪器成本高等。

适配体(Aptamer)是一类具有特异性结合靶标的人工合成短链核糖核苷酸(RNA)或单链脱氧核糖核苷酸(ssDNA)，其较抗体而言具有更明显的优势，如靶标范围更广、制备更方便、化学稳定性好和易修饰等。因此适配体作为生物传感器的特异性识别元件在食品安全控制、环境监测和临床诊断治疗等领域具有很大的潜力。

作为适配体传感器的重要组成部分，适配体具有对特定靶物质的高特异性、高亲和性。根据这一特点，现有的基于适配体的生物传感器大多以某种固定基质为载体，当靶物质存在时，其可以将适配体从固定载体上竞争洗脱下来，从而引发一系列的信号变化。

现有的适配体传感器大多是可以检测单个靶物质的，本发明以氯霉素和卡那霉素适配体为例，建立了可以同时检测两种抗生素的生物传感器，从而能够实现高效快速的抗生素检测。

发明内容

本发明的目的在于建立一个同时检测氯霉素和卡那霉素适配体传感器，降低检测成本，实现对抗生素残留的快速、高灵敏检测。本发明以氯霉素适配体和卡那霉素适配体为例，借助一条可以与两条适配体链部分碱基互补配对的辅助短链来固定两条适配体链，并通过对互补链的一端进行修饰生物素，来将互补链固定在链霉亲和素修饰的磁珠上。当两种抗生素存在时，由于其与对应的特异性适配体之间的特异性亲和作用，对应适配体被竞争性洗脱下来。利用两组不同的上下引物来分别通过实时荧光定量PCR方法检测上清液中两种适配体的含量，根据适配体核酸链的量来确定对应抗生素的含量。

氯霉素适配体信号放大传感器：

1.一种基于适配体的抗生素双检测传感器的建立，其特征在于：

1).合成以下序列，即氯霉素适配体和卡那霉素适配体：

氯霉素适配体(Apt-CAP):

5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAGCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’