[发明专利]靶向CD123和NKG2D配体的双特异嵌合抗原受体及应用

说明书

本发明公开一种靶向CD123和NKG2D配体的双特异嵌合抗原受体及应用，具体的公开1.一种同时表达抗CD123单链抗体和天然NKG2D胞外段，可靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体或其功能性变体；所述双特异性嵌合抗原受体有并联和串联两种连接方式；一种CAR及其构建体结构、构建体的核苷酸序列，以及包含该核苷酸序列的重组表达载体，并公开了相应表达载体的构建方式及其应用。本发明CAR结构赋予了T细胞更强和持久的增殖能力以及更强的抗肿瘤能力；本发明可以避免多次输注单靶点的CAR‑T细胞，不但减轻了对患者的伤害，也可以减轻其经济压力，具有较大的临床研究及应用价值。

技术领域

本发明涉及肿瘤生物免疫治疗领域，涉及一种双特异性嵌合抗原受体(CAR)。具体的，涉及一种同时靶向人CD123和人NKG2DL的、包含抗人CD123scFv和人NKG2D胞外段或其功能性变体的双特异性嵌合抗原受体(CAR)、重组表达载体、该CAR修饰的免疫应答细胞，及其制备方法和应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人为表达能识别特定的肿瘤表面抗原的抗原结合域，使T细胞获得抗体的特异识别肿瘤的能力，并通过CAR的胞内段信号区激活T细胞，使CAR-T细胞释放细胞因子、增殖并发挥细胞毒作用，靶向清除恶性肿瘤细胞。临床研究证实这类工程化的T细胞能够在体内扩增，长期存活并形成免疫记忆，对难治性血液肿瘤显示出高效的抗肿瘤活性。

目前CAR-T在治疗急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤中已经取得显著成绩，特别是以CD19作为靶抗原的CAR-T细胞免疫治疗。但在实体瘤以及髓系恶性肿瘤的治疗中仍然面临巨大挑战，至今在临床应用上进展缓慢。

近年来，嵌合抗原受体NK细胞即CAR-NK在恶性肿瘤治疗领域也获得较为瞩目的成绩。其作用机制与CAR-T细胞相类似。

CAR-T用于恶性肿瘤免疫治疗仍存在几大挑战：(1)实体瘤以及髓系恶性肿瘤内部为免疫抑制性微环境，可通过髓源性抑制性细胞(MDSC)和M2型巨噬细胞(M2)等免疫抑制细胞来抑制效应T细胞的增殖活性和抗肿瘤活性，从而导致CAR-T治疗效果不佳；因此作用于肿瘤微环境的免疫抑制细胞是提高CAR-T细胞治疗疗效的重要手段之一；(2)从目前的报道来看，多种单靶点CAR-T治疗实体瘤以及髓系恶性肿瘤效果较差，可能是由于肿瘤细胞靶抗原丢失从而逃脱了CAR-T的杀伤；克服这种肿瘤免疫逃逸的常规方法之一就是设计针对细胞膜上的2种或多种抗原的CAR-T细胞。(3)实体瘤以及髓系恶性肿瘤患者一般肿瘤负荷较重，需输入较多的CAR-T细胞才能发挥较明显的直接抗肿瘤作用。由此可知，将CAR-T细胞治疗等免疫疗法用于实体瘤以及髓系恶性肿瘤治疗仍需克服诸多困难。

我们认为，联合靶向人CD123和人NKG2DL双靶点免疫应答细胞(例如联合靶向CD123和NKG2DL的双靶点CAR-T细胞或者联合靶向CD123和NKG2DL双靶点CAR-NK细胞)可能会改善恶性肿瘤的治疗效果。

一方面，该免疫应答细胞可同时靶向肿瘤微环境和肿瘤细胞。肿瘤微环境中的免疫抑制细胞可抑制免疫应答细胞的功能。免疫抑制细胞主要包括MDSC、TAM和Treg等细胞。这些免疫抑制因素之间可以相互促进，例如，MDSC可以将TAM极化为具有免疫抑制功能的M2细胞，并能分泌IL-10和INF-γ招募Treg细胞。研究表明，肿瘤微环境中含量丰富的MDSC在肿瘤逃避免疫监视时起到关键作用。CD123和NKG2DL在MDSC、TAM上均有不同强度的表达，NKG2DL在Treg上也有表达。因此，靶向CD123和NKG2DL可抑制肿瘤微环境中免疫抑制细胞。同时含NKG2D片段的潜在地通过靶向肿瘤新脉管系统上表达的NKG2D配体的抗血管生成活性，通过直接靶向免疫抑制性髓样抑制细胞和调节性T细胞(Tregs)，以及募集髓样细胞和活化的巨噬细胞来调节免疫性肿瘤微环境，调动肿瘤-特异性适应性免疫应答等多重作用。