[发明专利]靶向CD123和NKG2D配体的双特异嵌合抗原受体及应用

权利要求书

1.一种同时表达抗CD123单链抗体和天然NKG2D胞外段，可靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体或其功能性变体；所述双特异性嵌合抗原受体有并联和串联两种连接方式；

其中所述抗CD123单链抗体(抗CD123scFv)的结构是针对包括MDSC、M2等免疫抑制性细胞和肿瘤细胞表面抗原CD123设计的特异性抗原结合域，可特异性与括MDSC、M2等免疫抑制性细胞和肿瘤细胞表面CD123结合；

所述抗CD123scFv由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成，VH和VL间通过至少一个接头(linker)连接，其排列方式可为VH—linker—VL或VL—linker—VH；

所述天然NKG2D胞外段主要表达于NK细胞，NKT细胞，CD8+αβT及部分γδT细胞的膜表面，可与表达于包括MDSC、M2等免疫抑制性细胞和肿瘤细胞表面的NKG2D配体(NKG2DL)相结合。

2.如权利要求1所述双特异性CAR的并联连接方式为：

1)可切割的结构域；

2)第一CAR，所述第一CAR包含(从羧基端到氨基端)：

第一信号肽结构域；

第一抗原结合结构域；

第一跨膜结构域；

第一共刺激信号结构域；和

第一胞内信号传导结构域；

3)第二CAR，所述第二CAR包含(从羧基端到氨基端)：

第二信号肽结构域；

第二抗原结合结构域；

第二跨膜结构域；

第二共刺激信号结构域；和

第二胞内信号传导结构域；

其中所述第一CAR和所述第二CAR通过所述可切割的结构域连接；

所述两个抗原结合结构域，其中之一抗原结合结构域为抗CD123scFv，另一抗原结合结构域为天然NKG2D胞外段。

3.如权利要求1所述双特异性CAR的串联连接方式为(从羧基端到氨基端)：

信号肽结构域；第一抗原结合结构域；第二抗原结合结构域；跨膜结构域；共刺激信号结构域；胞内信号传导结构域；

所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域，其中之一抗原结合结构域为抗CD123scFv，另一抗原结合结构域为天然NKG2D胞外段；所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可通过linker连接而成。

4.如权利要求1-3中所述的CAR，

其中抗CD123scFv包含：含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

其中NKG2D胞外段包含：含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

5.如权利要求1-4中任一项所述的CAR构建体，其中所述信号肽结构域包括但不限于人CD8α信号肽、人IL-2信号肽、人GM-CSF信号肽、人胰岛素信号肽、人胰蛋白酶原信号肽。

所述人CD8α信号肽氨基酸序列包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。所述人IL-2信号肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

6.如权利要求1-4中任一项所述的CAR构建体，其中所述跨膜结构域与所述抗原结合域之间可直接连接或由铰链结构域连接；

跨膜结构域包括但不限于人CD8α跨膜区、人CD28跨膜区、人CD4跨膜区、人CD28跨膜区、人CD3ζ跨膜区、人CD137/4-1BB跨膜区、人CD134/OX40跨膜区、人ICOS跨膜区、人CD5跨膜区、人CD9跨膜区、人CD16跨膜区、人CD22跨膜区、人CD33跨膜区、人CD37跨膜区、人CD45跨膜区、人CD64跨膜区、人CD80跨膜区、人CD86跨膜区、人CD154跨膜区、人TCRα跨膜区、人TCRβ跨膜区；

所述铰链结构域包括但不限于人CD8α铰链区、人CD28铰链区、人免疫球蛋白恒定区或其变体、人免疫球蛋白铰链区、人IgG4铰链区、人免疫球蛋白CH1/CL区、Fc区、人免疫球蛋白CH2结构域、人免疫球蛋白CH3结构域和/或它们的任何组合；

所述人CD8α跨膜区包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，所述人CD28跨膜区包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列；所述人CD8α铰链区包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。