[发明专利]一种F基因型腮腺炎减毒活疫苗的规模化制备方法

权利要求书

1.一种F基因型腮腺炎减毒活疫苗的规模化制备方法，包括以下步骤：

(1)配制所需的各种试剂和溶液备用：

MEM培养基：每1000mL MEM培养基含9.4g MEM干粉；

MEM培养液：每1000mL MEM培养液含有6.6％NaHCO₃ 30mL，3％谷氨酰胺20mL，新生牛血清100mL和MEM培养基850mL；

MEM维持液：每1000mL MEM维持液含有6.6％NaHCO₃ 40mL，3％谷氨酰胺20mL和MEM培养基940mL；

PBS溶液：每1000mL PBS溶液中含有：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂0 2.87g和KH₂PO₄ 0.2g，以注射用水定容至1000mL，pH为7.3～7.5；

胰蛋白酶消化液：每1000mL胰蛋白酶消化液含有1％NaOH 2.5mL，4％EDTA·2Na3.5mL,1％胰蛋白酶125mL和PBS溶液869mL；

冻干保护剂：每1000mL冻干保护剂含有：蔗糖80g、海藻糖80g、甘氨酸20g、右旋糖酐20g、人白蛋白10ml、精氨酸2g和谷氨酸钠1g，以注射用水定容至1000mL；

(2)KMB-17细胞的传代与计数：取复苏好的KMB-17细胞加入胰蛋白酶消化液消化细胞，然后加入预温到37℃的MEM培养液，转入细胞工厂传代培养，在37℃培养4～5d，挑选无污染且生长状态良好的细胞工厂进行计数，细胞总数应不低于3.75×10⁸/细胞工厂；

(3)病毒收获液的制备：弃去细胞工厂中的旧培养液，然后清洗细胞：每个细胞工厂加入1000mL PBS溶液，轻轻摇晃4～6次，弃去洗液；浸泡细胞：每个细胞工厂加入1000mL PBS溶液，浸泡10min，弃去洗液；再重复上述清洗与浸泡操作各一次；然后在每个细胞工厂中加入1500mL预温至37℃的MEM维持液，按照MOI值0.020接种F基因型腮腺炎病毒毒种，置于37℃培养7～9d，收集上清液即为病毒收获液；

(4)疫苗原液制备：病毒收获液经50μm滤器和10μm滤器顺序过滤后，得到疫苗原液；

(5)疫苗半成品制备：在疫苗原液中加入等量冻干保护剂，混匀后得到疫苗半成品；

(6)疫苗成品制备：疫苗半成品再经分装、冻干后得到病毒含量不低于4.30lgCCID₅₀/mL的F基因型腮腺炎减毒活疫苗成品。

2.根据权利要求1所述的F基因型腮腺炎减毒活疫苗的规模化制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的转入细胞工厂传代培养按照下述流程进行：1个培养瓶→4个培养瓶→16个培养瓶→2个细胞工厂→4个细胞工厂→12个细胞工厂。

3.根据权利要求1所述的F基因型腮腺炎减毒活疫苗的规模化制备方法，其特征在于：步骤(6)所述的冻干操作具体为：制冷控制：降温至5℃保持60min，然后快速制冷至-32℃，保持180min；抽真空降压：压力降至0.35mbar；一次干燥：升温至-28℃，压力降至0.02mbar；解吸干燥：升温至28℃，压力降至0.01mbar；压力升高不超过0.03mbar进行压塞，再充气至常压时结束冻干；整个冻干工艺时长66～70h，在冻干过程中温度达到稳定状态后，温度波动范围不超过±2.0℃。