[发明专利]一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法

说明书

本发明涉及一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，包括以下步骤：（1）消毒；取刚产出体外的新鲜受精蛋，使用1%新洁尔灭清洗蛋壳，再用75%酒精擦拭蛋壳表明进行消毒；（2）取样；在超净台中药勺法取出新鲜受精蛋的胚盘，PBS清洗三遍，用移液枪轻轻吹匀，制备成单细胞悬液；（3）单细胞测序仪器进行上机建库；（4）对测序数据进行分析；（5）细胞亚群的鉴定。通过本发明，可以准确的鉴定胚盘中细胞的种类，与传统的测序方式不同，单细胞测序可以检测细胞之间的异质性，在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析，在相关研究中具有极高的准确性和可信度。

技术领域

本发明涉及一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，属于生物技术、设计动物组织与细胞工程等领域。

背景技术

BCs（鸡囊胚细胞）作为潜在的胚胎干细胞，在胚胎发育动物模型、家禽种质资源的保存以及家禽转基因技术等方面有广阔的应用前景。并且鸡胚作为经典的胚胎生物学模型，价格低廉且容易获得，因此鸡胚胚盘细胞在动物发育模型（如细胞的起源与分化）上具有广泛的应用前景。Eyal-Giladi等将第一次卵裂到鸡胚原条形成的这段早期发育阶段分为I-XIV期，当鸡蛋刚产出体外时已发育至囊胚期，此时胚盘中有大约50000-60000个细胞，但其中的细胞种类未有详细的研究。随着技术的发展，单细胞测序技术（single cellsequencing）越来越多应用到细胞的分析研究中。单细胞测序技术是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术，它能够弥补传统高通量测序的局限性，揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性。这项技术刚好可以解决这个问题。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有问题，提供一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法。

本发明的目的是这样实现的，一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）消毒；取刚产出体外的新鲜受精蛋，使用1%新洁尔灭清洗蛋壳，再用75%酒精擦拭蛋壳表明进行消毒；

（2）取样；在超净台中药勺法取出新鲜受精蛋的胚盘，PBS清洗三遍，用移液枪轻轻吹匀，制备成单细胞悬液；

（3）单细胞测序仪器进行上机建库；将单细胞悬液加入单细胞测序仪器的上样孔中，开机后单细胞悬液中每个细胞和微粒一起在仪器中会被单个油滴包裹，微粒上面有扩增所需的引物，并且每条引物以及每个油滴都有唯一的标记；随后PCR扩增后进行高通量测序，因此可以单独检测出每个细胞内所有基因的表达量；

（4）对测序数据进行分析；单个细胞的所有mRNA进行高通量测序后，软件分析细胞内所有基因的表达模式，使用seurat软件进行主成分分析降维后，利用非线性降维算法t-sne来调整数据，将多维数据降为二维空间；经过降维处理后，所有数据都映射到二维空间，空间上每个点都代表一个细胞，点之间的距离就是指平面上两个点的直线距离，其代表着细胞之间的相似性，细胞之间越相似，他们的基因的表达模式就越接近，那么平面上显示出来的点之间的距离就越近；因此点之间的距离可以决定是否属于相同的细胞类型，然后用k-means算法来把细胞聚类分群；

（5）细胞亚群的鉴定；亚群分好后，需要借助标记基因来鉴定，通过CellMarker网站来找到人和鼠早期胚胎中不同细胞类型的标记基因，从现有的早期鸡胚中不同细胞中表达的基因作为参考，通过热图展现出亚群中高表达基因的表达情况，与准备好的标记基因进行比对，鉴定出每个亚群的细胞类型。

步骤（2）中，胚盘的分离时，将受精蛋大头朝上拿住，使用镊子将蛋中间部分敲开，小心的掀去上半部分蛋壳，用药勺去除蛋黄周围的蛋清，用消毒后的剪刀沿着胚盘周围一圈剪开，置于装有PBS溶液的培养皿中，轻轻摇晃，当胚盘脱落下来后用吸管轻轻吸取到干净的装有PBS溶液的培养皿中，重复清洗三遍。