[发明专利]一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立及应用

说明书

本发明公开了一种构建人多能干细胞中可诱导高效表达的基因体系，具体是基于PiggyBac转座子系统，在体外快速通过无缝克隆的方式构建含外源基因的PiggyBac转座子质粒，并通过与含转座酶基因的PB200PA质粒共转染人多能干细胞，建立起可以通过DOX诱导高效表达外源基因的人多能干细胞模型，该方法简单快捷，构建所得的基因体系稳定，且可在人多能干细胞中高效表达特定外源基因，并能实现在特定时间诱导外源基因过表达，可以广泛应用于多能干细胞的相关基因研究中。

技术领域

本发明涉及表达基因体系的建立技术，具体是涉及一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立及应用。

背景技术

人多能干细胞具有强大的自我更新、自我复制能力，并且可以分化成体内所有的细胞，形成人体内所有组织和器官。在体外进行人多能干细胞的培养为器官再生、修复和疾病治疗方面的研究提供了强大的推动力。在对增殖、分化、迁移调控相关影响因素的基础研究，细胞移植及基因载体治疗的临床研究及移植治疗疾病过程中的机制研究等方面具有巨大的应用前景。

近些年来，由于种属差异，动物模型与人类在生理、病理情况下存在很大差异，很多研究结果不能应用于人类。尤其是在基础研究领域，损伤修复及移植治疗疾病过程研究中，对于细胞外基质相关蛋白、细胞生长因子、信号传导通路等对细胞多能性、增殖、分化、迁移及移植治疗中影响多向分化潜能的细胞因子及相关基因的机制仍不清楚。因此，如何在体外建立高效表达外源性基因的人多能干细胞的方法对于研究以上问题具有重要作用。

目前对于过表达基因的人多能干细胞的建立主要采用慢病毒载体系统使外源性基因整合到宿主基因组中，但由于人多能干细胞自身的特性使得对于病毒载体启动子的要求极为苛刻及对病毒浓度、纯度的高要求和通过电转体系建立过表达的人多能干细胞系由于其对电转体系的高要求及电穿孔造成的细胞较高死亡率使得外源性基因表达受到限制，因此探索新的方法快速、高效地实现外源性基因的表达具有重要的意义。

PiggyBac转座子系统具有转座效率高、删除精确、半随机插入和携带片段较大等优点。但是作为一种转基因实验的工具，特别是在哺乳动物个体水平的转基因方面，还存在转基因效率待提高、外源基因随机插入对内源基因破坏的风险待降低等问题待解决。

发明内容

本发明的目的是克服现有多能干细胞中过表达外源基因效率低等技术的不足，提供一种构建人多能干细胞中可诱导高效表达的基因体系，该方法简单快捷，构建所得的基因体系具有以下优点：体系稳定；可在人多能干细胞中高效表达特定外源基因；可在特定时间诱导外源基因过表达等。基于该体系的构建方法可以阐明该基因在干细胞中相关功能及调节机制。

本发明的具体方案如下：

一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，包括以下步骤：

步骤一：使用无缝克隆的方式构建TRE6P-P2A-EGFP质粒；

步骤二：构建含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒；

步骤三：使用所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒和含转座基因酶的PB200PA质粒共转染人多能干细胞；

步骤四：建立表达所述外源基因的稳定细胞株。

进一步的，使用强力霉素(记作DOX)诱导所述外源基因的表达。

优选的，所述强力霉素的浓度为1～2ug/ml，诱导时间为20～30小时。

优选的，所述TRE6P-P2A-EGFP质粒的构建具体包括以下步骤：

步骤一：设计P2A-EGFP特异性无缝克隆引物：包括P2A-EGFP正向引物(如SEQ ID:1所示)和P2A-EGFP反向引物(如SEQ ID:2所示)，进行PCR扩增，得到P2A-EGFP片段；