[发明专利]一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立及应用在审
| 申请号： | 202010742701.8 | 申请日： | 2020-07-29 |
| 公开（公告）号： | CN111996214A | 公开（公告）日： | 2020-11-27 |
| 发明（设计）人： | 王永煜;权颖怡 | 申请（专利权）人： | 温州医科大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/90 |
| 代理公司： | 北京祺和祺知识产权代理有限公司 11501 | 代理人： | 胡草 |
| 地址： | 325000 浙江省温州市瓯海*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 多能 干细胞 诱导 高效 表达 基因 体系 建立 应用 | ||
1.一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：使用无缝克隆的方式构建TRE6P-P2A-EGFP质粒；
步骤二：构建含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒；
步骤三：使用所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒和含转座基因酶的PB200PA质粒共转染人多能干细胞；
步骤四：建立表达所述外源基因的稳定细胞株。
2.根据权利要求1所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：使用强力霉素诱导所述外源基因的表达。
3.根据权利要求2所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：所述强力霉素的浓度为1～2ug/ml，诱导时间为20～30小时。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：所述TRE6P-P2A-EGFP质粒的构建具体包括以下步骤：
步骤一：设计P2A-EGFP特异性无缝克隆引物：包括P2A-EGFP正向引物(如SEQ ID:1所示)和P2A-EGFP反向引物(如SEQ ID:2所示)，进行PCR扩增，得到P2A-EGFP片段；
步骤二：对PB-TRE6P质粒进行酶切、跑胶、纯化；
步骤三：将所述P2A-EGFP片段插入所述经步骤二处理过的PB-TRE6P质粒中，再经筛选获得所述TRE6P-P2A-EGFP质粒。
5.根据权利要求4所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：
所述P2A-EGFP片段的插入位置为所述经步骤二处理过的PB-TRE6P质粒的TRE3G启动子和3Xflag序列中间。
6.根据权利要求5所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：所述转染过程包括以下步骤：
步骤一：将所述人多能干细胞培养到密度为3.5～4.5x105个细胞/35mm培养皿，更换干细胞培养液；
步骤二：将所述人多能干细胞滴入含有所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒的脂质体转染培养液中；
步骤三：每天更换所述脂质体转染培养液，得到转染了含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒的人多能干细胞。
7.根据权利要求1或6所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：
所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒的质量比为(4～7):1。
8.根据权利要求6所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：
所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒的脂质体转染培养液的具体制备方法为：将所述含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒与所述PB200PA质粒加入到培养液中，随后将所述培养液稀释80～120倍，再转移到含有脂质体转染试剂的培养液中混匀、静置。
9.根据权利要求8所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：
将所述转染了含过表达外源基因的PiggyBac转座子质粒的人多能干细胞培养到密度为8.5～9.5x105个细胞/35mm培养皿，使用嘌呤霉素处理细胞，经传代筛选获得所述稳定细胞株。
10.根据权利要求9所述的一种人多能干细胞中可诱导高效表达基因体系的建立，其特征在于：所述嘌呤霉素的浓度为0.5～1ug/ml，并传代筛选2～4代。
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