[发明专利]一种提高益生菌耐受环丙沙星的方法

说明书

本发明公开了一种提高益生菌耐受环丙沙星的方法，通过构筑基于益生菌表面的可“穿‑卸”双组分多糖人造细胞壁，对酵母细胞进行保护性包覆和可控脱去，提高酿酒酵母等益生菌耐受过量抗生素的能力。本发明以酿酒酵母益生菌为基本微生物体，通过制备羧甲基壳聚糖(CMCS)和羧基葡聚糖(DEX‑COOH)，对其进行细胞表面涂层以形成双组分多糖人造细胞壁，利用壳聚糖酶专一性降解作用以达到所构筑人造细胞壁的降解，实现其“穿‑卸”过程。这种方法使微生物体得到充分的保护作用，不仅维持酿酒酵母益生菌的高活性，还提高其耐受过量抗生素的能力。

【技术领域】

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高益生菌耐受环丙沙星的方法。

【背景技术】

近年来，抗生素作为水产养殖业中不可替代的功能性饲料添加剂，广泛应用于水产养殖业中以减轻传染病、提高生长性能及增强免疫力。水产养殖业中的过度依赖抗生素，导致日愈严重的抗生素滥用问题，以及进一步危害人类健康和水体环境污染，使水产养殖业面临巨大的挑战，迫切需要发展益生菌等天然的功能性饲料添加剂。益生菌作为一种有益的活性微生物，可赋予宿主抑制细菌性疾病、提高机体免疫反应及推动水体物质循环等多种有益的作用，在水产养殖业中备受青睐。但是，抗生素的滥用会导致严重的问题。

随着饲料添加剂在水产养殖业的需求增长，为了在水产养殖业中能够起到减轻传染病、提高生长性能及增强免疫力等作用，避免过量的抗生素危害包括益生菌在内的微生命体而导致其死亡和功能性丧失，在降低抗生素使用量与增加益生菌使用频率的同时，迫切需要发展有效的方法去保护益生菌免受抗生素的伤害。因此，设计辅助益生菌抵抗抗生素危害的防控材料，探索提高益生菌生物活性的新方法是保护益生菌的重要措施。例如，通过微囊化技术为益生菌包上壳聚糖-海藻糖囊材以保护益生菌免受恶劣条件影响[ZhouH.,Chen J.,Li S.,et al.Preparation of Acid-Resistant Microcapsules withShell-Matrix Structure to Enhance Stability of Streptococcus ThermophilusIFFI 6038.Journal of Food Science.2017,82(8)：1978-1984.]。

因此，通过细胞表面工程技术，考虑与天然细胞壁成分相近的涂层材料，进一步提高细胞相容性，赋予细胞更好的保护作用，该材料对细胞起到很好的保护作用，可以抵御外界有害物质的入侵及不利环境且具有捕集小分子物质的能力，该方法利用蛋白质和葡聚糖为构建基元，与细胞表面的组成结构膜蛋白和多糖相类似，细胞相容性有所改善，赋予细胞多功能性作用[Su D,Liu X,Liu L,et al.In situ self-assembly of coacervatemicrodroplets into viable artificial cell wall with heritability.AdvancedFunctional Materials,2018,28(10)：1705699.]。

基于此，探索一种保护益生菌免受抗生素危害的新方法在益生菌应用领域具有产业意义和科学研究价值。

【发明内容】

本发明目的在于提供一种提高益生菌耐受环丙沙星的方法，通过构筑基于益生菌表面的可“穿-卸”双组分多糖人造细胞壁，对酵母细胞进行保护性包覆和可控脱去，提高酿酒酵母等益生菌耐受过量抗生素的能力。

本发明所述的一种提高益生菌耐受环丙沙星的方法，包括以下步骤：

1)制备羧甲基壳聚糖(CMCS)：

采用异丙醇分散壳聚糖，得到壳聚糖分散液；采用去离子水溶解氢氧化钠，加入壳聚糖分散液后，置于油浴中碱化；采用异丙醇溶解氯乙酸，然后逐滴加入碱化后的壳聚糖溶液中，反应后，加入盐酸终止反应，静置冷却，倒掉上清液，取底部产物用甲醇及乙醇清洗，置于真空干燥箱中干燥，最后得到羧甲基壳聚糖；