[发明专利]一种提高益生菌耐受环丙沙星的方法

权利要求书

1.一种提高益生菌耐受环丙沙星的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）制备羧甲基壳聚糖：

采用异丙醇分散壳聚糖，得到壳聚糖分散液；采用去离子水溶解氢氧化钠，加入壳聚糖分散液后，置于油浴中碱化；采用异丙醇溶解氯乙酸，然后逐滴加入碱化后的壳聚糖溶液中，反应后，加入盐酸终止反应，静置冷却，倒掉上清液，取底部产物用甲醇及乙醇清洗，置于真空干燥箱中干燥，最后得到羧甲基壳聚糖；所述壳聚糖质量与分散其的异丙醇体积之比为50mg：5mL，氢氧化钠去离子水溶液的质量浓度与壳聚糖分散液的质量浓度之比为10:1，氯乙酸质量与溶解其的异丙醇体积之比为(100-200)mg：(5-15)mL；

2）制备羧基葡聚糖：

将葡聚糖溶于二甲基亚砜中配制葡聚糖溶液，再向葡聚糖溶液中加入丁二酸酐和催化剂4-二甲氨基吡啶，在油浴中磁力搅拌反应，然后，加入4倍于二甲基亚砜体积的去离子水，冷却，透析，冷冻干燥，得到羧基葡聚糖；所述葡聚糖的质量与二甲基亚砜的体积比为(100-300)mg：(10-20)mL，丁二酸酐的质量与二甲基亚砜的体积比为(300-450)mg：(10-20)mL，葡聚糖与4-二甲氨基吡啶的质量比为1：(0.01-0.1)；

3）“穿-卸”过程：

选择酿酒酵母细胞为微生物体，利用YPD培养基在培养箱中进行培养以达到细胞生长对数期时进行包覆；采用去离子水对生长对数期的酿酒酵母细胞进行清洗，离心收集细胞并分散在去离子水中得到细胞溶液，将羧甲基壳聚糖溶液和羧基葡聚糖溶液相继加入到细胞溶液中，将细胞溶液在旋转混匀仪下旋转混匀，反应完成后，离心清洗收集包覆后的酿酒酵母细胞，得到“穿上”人造细胞壁的细胞溶液；将壳聚糖酶溶于水中配制壳聚糖酶溶液，加入到包覆后的酿酒酵母细胞溶液中，离心清洗收集酿酒酵母细胞溶液，得到“卸去”人造细胞壁的细胞溶液；所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为2-3mg/mL，羧基葡聚糖溶液的浓度为4-6mg/mL，壳聚糖酶溶液的浓度为1-3mg/mL，细胞溶液的OD值为1-2；

4）耐受环丙沙星：

将环丙沙星溶于盐酸溶液中配制环丙沙星溶液，分别加入天然酵母细胞和“穿上”人造细胞壁的酵母细胞溶液，离心清洗收集耐受环丙沙星后的细胞溶液，利用FDA-PI双荧光染色剂对细胞液染色，通过共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞仪检测细胞死活情况；所述环丙沙星溶液的浓度为0.05-0.50mg/mL，盐酸溶液的浓度为0.01-0.05M，细胞溶液的OD值为1-2。

2.根据权利要求1所述的一种提高益生菌耐受环丙沙星的方法，其特征在于：步骤1）所述的制备羧甲基壳聚糖，是：采用异丙醇分散壳聚糖，得到壳聚糖分散液，壳聚糖质量与分散其的异丙醇体积之比为50mg：5mL；采用去离子水溶解氢氧化钠，氢氧化钠去离子水溶液的质量浓度与壳聚糖分散液的质量浓度之比为10:1，加入壳聚糖分散液后，置于30-90℃的油浴中碱化30-60min；采用异丙醇溶解氯乙酸，氯乙酸质量与溶解其的异丙醇体积之比为(100-200)mg：(5-15)mL，然后以50-100μL/min的速率逐滴加入碱化后的壳聚糖溶液中，反应3-6h后，加入质量分数为10%盐酸终止反应，静置冷却，倒掉上清液，取底部产物分别用10mL的80%甲醇及70%乙醇清洗，置于50℃的真空干燥箱中干燥12 h，最后得到羧甲基壳聚糖。

3.根据权利要求2所述的一种提高益生菌耐受环丙沙星的方法，其特征在于：步骤1）中所述氯乙酸质量与溶解其的异丙醇体积之比为150mg：10mL。

4.根据权利要求1所述的一种提高益生菌耐受环丙沙星的方法，其特征在于：步骤2）所述的制备羧基葡聚糖，是：将葡聚糖溶于二甲基亚砜中配制葡聚糖溶液，葡聚糖的质量与二甲基亚砜的体积比为(100-300)mg：(10-20)mL，再向葡聚糖溶液中加入丁二酸酐和催化剂4-二甲氨基吡啶，丁二酸酐的质量与二甲基亚砜的体积比为(300-450)mg：(10-20)mL，葡聚糖与4-二甲氨基吡啶的质量比为1：(0.01-0.1)，在40-100℃油浴中磁力搅拌反应10-20h，然后，加入4倍于二甲基亚砜体积的去离子水，冷却，透析，冷冻干燥，得到羧基葡聚糖。