[发明专利]一种基于单细胞起源的番木瓜高效植株再生方法

说明书

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种番木瓜植株再生方法，更具体涉及一种基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法。本发明所述基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法，利用合适的番木瓜未成熟种子进行胚性愈伤组织诱导，进一步经继代增殖培养后，经液体继代培养和筛选获得均质的胚性细胞悬浮系；然后利用胚性细胞诱导形成体细胞胚，进而经萌发培养和生根培养后获得大量完整的再生植株。本发明所述方法可以通过单细胞起源途径获得再生，能在短时间内低成本生产出大批量种苗，具有生根容易、根系不会出现愈伤化、再生率高、周期短、所需生产空间小、生产成本低的优势，适宜于番木瓜细胞工程育种和分子育种的推广。

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种番木瓜植株再生方法，更具体涉及一种基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法。

背景技术

番木瓜(Carica papaya L.)又称木瓜、乳瓜、万寿果，是热带、亚热带常绿软木质大型多年生草本植物，有“岭南佳果”的美誉，其营养价值排在世界十大营养水果的首位，是我国农业品种结构调整的重要经济作物。

目前，我国番木瓜产业发展面临的主要问题即为环斑花叶病毒病的侵害，造成番木瓜产量大大降低，甚至部分老产区已经无法种植番木瓜。因此，番木瓜产业亟需培育新的抗病品种以改善番木瓜的抗病性、产量和质量。但是，由于我国不是番木瓜种植的起源中心，缺乏抗病资源物种，难以通过杂交育种的途径培育优质的抗病品种。除此之外，解决番木瓜种植问题的另一可行性方案即为通过导入外源抗性基因进而获得抗性的分子育种，但该方案实施的前提是需要建立高效的植株再生技术体系，这也成为该途径改善番木瓜育种的重点和难点。

目前，番木瓜植株再生技术通常是以成年植株的茎尖或侧芽为外植体，通过消毒、分化增殖获得大量分化芽后，经生根培养获得再生植株。但是，基于该再生技术体系进行基因转化时非常容易出现嵌合体、假阳性和基因丢失的情况，进而导致转化效率较低，并且不容易达到育种的目的，这也是目前限制番木瓜培育技术发展的关键难点。

胚性细胞悬浮系是现有更适用于生物技术育种的植株再生技术，由于胚性细胞悬浮系起源于单细胞，在以胚性细胞悬浮系为受体进行基因转化时可避免再生植株出现嵌合体、假阳性和基因丢失的情况，进而转化效率也大大提高。现有技术已开发出多种植物基于胚性细胞悬浮系的植株再生技术。但是，基于单细胞起源的胚性细胞悬浮系进行番木瓜植株的再生则并未有报道，而且，如何建立理想的均质的胚性细胞悬浮系，以提高植株再生效率的方法也成为番木瓜分子育种的关键因素，引起人们的广泛关注和研究。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法，具有生产成本低、体细胞胚诱导率高、植株再生率高的优势。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法，包括如下步骤：

(1)胚性愈伤组织诱导和增殖培养

取未成熟果实种子剥除外层种壳，剔除未成熟幼胚种皮，获得所需外植体；随后将所述外植体未成熟幼胚置于愈伤组织诱导固体培养基(MI)中进行诱导培养，得到松散易碎的浅黄色胚性愈伤组织；并将所述胚性愈伤组织继续进行继代培养，得到增殖的胚性愈伤组织；

(2)均质胚性细胞悬浮系的建立

取增殖后的胚性愈伤组织置于愈伤组织诱导液体培养基(ML)中进行液体悬浮培养，并在每个继代周期培养结束后滤除较大颗粒培养物；随后继续进行重复液体悬浮继代培养和筛选，直到得到均质胚性细胞悬浮系；

(3)体细胞胚的诱导和成熟培养

取得到的均质胚性悬浮细胞置于体细胞胚诱导培养基(MSD1)中进行体细胞胚诱导培养，并于体细胞成熟培养基(MSD2)进行成熟培养，得到成熟体细胞胚；

(4)体细胞胚的萌发、生根和植株再生