[发明专利]一种基于单细胞起源的番木瓜高效植株再生方法

权利要求书

1.一种基于单细胞起源的番木瓜植株高效再生方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）胚性愈伤组织诱导和增殖培养

取未成熟种子剥除外层种壳，剔除未成熟幼胚种皮，获得所需外植体；随后将所述外植体未成熟幼胚置于愈伤组织诱导固体培养基MI中进行诱导培养，得到松散易碎的浅黄色胚性愈伤组织；并将所述胚性愈伤组织继续进行继代培养，得到增殖的胚性愈伤组织；

所述愈伤组织诱导固体培养基MI为如下组分：1/2 MS培养基、2-4mg/L 2,4-D、400mg/L谷氨酰胺、50-70g/L蔗糖、5-10g/L琼脂粉，调pH5.5-6.0；

（2）均质胚性细胞悬浮系的建立

取增殖后的胚性愈伤组织置于愈伤组织增殖液体培养基ML中进行液体悬浮培养，并在每个继代周期培养结束后滤除较大颗粒培养物；随后继续进行重复液体悬浮继代培养和筛选，直到得到均质胚性细胞悬浮系；

所述愈伤组织增殖液体培养基ML为如下组分：1/2 MS培养基、2-4mg/L 2,4-D、350-450mg/L谷氨酰胺、50-70g/L蔗糖，调pH5.0-5.5；

（3）体细胞胚的诱导和成熟培养

取得到的均质胚性悬浮细胞置于体细胞胚诱导培养基MSD1中进行体细胞胚诱导培养，并于体细胞成熟培养基MSD2进行成熟培养，得到成熟体细胞胚；

所述体细胞胚诱导培养基MSD1为如下成分：1/2MS大量元素和微量元素及其铁盐、MS维生素、40-60mg/L肌醇、300-500mg/L谷氨酰胺、25-35g/L蔗糖，调pH5.0-5.5；

所述体细胞成熟培养基MSD2为如下成分：1/2MS大量元素和微量元素及其铁盐、MS维生素、40-60mg/L肌醇、300-500mg/L谷氨酰胺、25-35g/L蔗糖、8-12g/L活性炭、5-10g/L琼脂粉，调pH5.5-6.0；

（4）体细胞胚的萌发、生根和植株再生

取得到的成熟体细胞胚置于萌发培养基MG中进行萌发和生根培养，进一步并将萌发和生根后的小植株转移至成苗培养基MR中发育得到完整的小植株；

所述萌发培养基MG为如下成分：MS大量元素、微量元素、铁盐及其维生素、0.1-0.2mg/L6-BA、0.1-0.2mg/L NAA、300-500mg/L谷氨酰胺、4-6g/L活性炭、20-40mgl/L蔗糖、5-10g/L琼脂粉，调pH5.5-6.0；

所述成苗培养基MR为如下成分：1/2MS大量元素、微量元素、铁盐及其维生素、0.05-0.1mg/L 6-BA、1-2mg/L IBA、4-6g/L活性炭、25-35mgl/L蔗糖、5-10g/L琼脂粉，调pH5.5-6.0；

所述的MS培养基成分为：

大量元素：1650mg/L NH₄NO₃，1900mg/L KNO₃，170mg/L KH₂PO₄，370mg/L MgSO₄，440mg/LCaCL₂·2H₂O；

微量元素：0.83mg/L KI，6.2mg/L H₃BO₃，22.3mg/L MnSO₄·H₂O，10.6mg/L ZnSO₄ ·H₂O ，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg/L CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L CoCL₂·6H₂O；

有机物：0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2.0mg/L甘氨酸；铁盐：27.8mg/L FeSO₄ · 7H₂O ，37.3mg/L Na₂·EDTA；

所述步骤（1）中：

所述未成熟种子指开花坐果后发育90-120天果实的种子；

所述诱导培养步骤中，控制反应过程为暗培养，培养温度为28±1℃，培养时间60-90天；

所述继代培养步骤中，控制反应过程为暗培养，培养温度为28±1℃，以30天为一个继代周期，继代培养2-3个周期；

所述步骤（2）中：

所述液体悬浮培养步骤中，第一个继代周期控制反应过程为暗培养，培养温度为28±1℃，培养时间为2周，使用800-1000μm孔径的筛网滤除较大颗粒培养物；

所述液体悬浮均质筛选和继代培养步骤中，控制反应过程为暗培养，培养温度为28±1℃，以21天为一个继代周期，使用160-160μm孔径的筛网滤除较大细胞团，继代培养3-5个继代周期。