[发明专利]一种骨肉瘤类器官的培养方法及其骨肿瘤培养基

权利要求书

1.一种骨肉瘤类器官3D培养模型的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)组织清洗:用含1xPen-Strep Glutamine ADMEM/F12 10ml清洗2-5遍；

(2)将组织切成1mm³大小后，用消化液消化30-60分钟，消化后4℃，1200r离心5min；

(3)用含1x Pen-Strep Glutamine ADMEM/F12 10ml清洗3遍；

(4)100uM细胞筛过滤后计数离心，Collagen加1-100ug/ml laminin中重悬后铺板；

(5)培养期间每3-4天更换一次骨肿瘤培养基；

(6)类器官一般每15-20天传代1次，传代时每孔加入2-5倍量的TrpLE Express。

2.根据权利要求1所述的骨肉瘤类器官3D培养模型的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的消化液包括如下组分组成：

3.根据权利要求1所述的骨肉瘤类器官3D培养模型的制备方法，其特征在于：在步骤(4)中，铺板24孔板每孔50ul Collagen含1000个细胞/细胞团，37℃凝固10分钟，加培养基500ul/孔。

4.根据权利要求1所述的骨肉瘤类器官3D培养模型的制备方法，其特征在于：在步骤(6)中，在37℃时消化5-10分钟，加1/10体积FBS终止消化，室温600g离心5分钟，Collagen中重悬24孔板每孔50ul Collagen含1000个细胞/细胞团，37℃凝固10分钟，加骨肿瘤培养基500ul/孔。

5.一种骨肉瘤类器官的气液培养模型的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)制备胶原基质；

(2)底部胶原层制备：在30mm，0.4um迁移小室中加1ml胶原基质，室温凝固20min或37℃凝固10min；

(3)肿瘤组织剪碎(0.3mm³及以下)，此步在冰上操作，在含1X Normocin的ADMEM/F12洗两遍，400g离心3min；

(4)上部胶原层制备：用1ml胶原基质添加1-100ug/ml laminin(层粘连蛋白)(1ml/30mm迁移小室)将剪碎的肿瘤组织重悬；

(5)将含有组织的胶原层加入到提前在30mm,0.4um迁移小室上凝固好的1ml胶原基质的上部，制备出一个双层的气-液培养体系；室温凝固20min或37℃凝固10min；

(6)在外层60mm细胞培养皿中加入1.5ml骨肿瘤培养基培养；

(7)培养期间每3-4天更换一次骨肿瘤培养基；

(8)类器官一般每20-35天传代1次，传代时用300U/ml IV型胶原酶37℃消化30-40分钟，后加I型DNA酶200units/ml，37℃消化10分钟，加ADMEM/F12到10mL，600g离心3min，弃上清，重复2遍。按照1：3或者1：4比例传代到新的迁移小室中培养。

6.根据权利要求5所述的骨肉瘤类器官的气液培养模型的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，Collagen胶原基质的制备方法：

所述的Cellmatrix type I-A、10×Ham’s F-12、缓冲液的比例为8：1：1，骨肿瘤培养另加50ug/ml laminin。

7.根据权利要求6所述的骨肉瘤类器官的气液培养模型的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，缓冲液由含0.05N NaOH、200mM HEPES和2.2g NaHCO₃的无菌水组成。

8.权利要求1至7任一项所述的骨肉瘤类器官的培养方法中的骨肿瘤培养基，其特征在于：所述的骨肿瘤培养基包括如下组分组成：

9.根据权利要求8所述的骨肉瘤类器官的培养方法中的骨肿瘤培养基，其特征在于：所述的高级DMEM/F12培养基由F12培养基和DMEM培养基组成，所述的F12培养基与DMEM培养基的体积比为1:1，称为dmem/f12；Wnt3a条件培养基：Wnt3A-ConditionedMedium由细胞株制备的上清液处理而成，制备用Wnt-3A细胞株购自中科院细胞库。