[发明专利]一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体及构建方法

说明书

本发明公开了一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体及构建方法，涉及生物技术领域，其技术方案要点是：将慢病毒载体pSLenti‑U6‑shRNA‑CMV‑EGFP‑2A‑Puro中的CMV‑EGFP‑2A‑Puro基因元件替换为hSyn‑mNeonGreen基因，核酸序列如SEQ ID NO.1所示，得到载体pSLenti‑U6‑shRNA‑hSyn‑mNeonGreen；将慢病毒载体pSLenti‑U6‑shRNA‑hSyn‑mNeonGreen中的shRNA基因替换为miR30(mmu‑miR‑29a‑3p)基因，核酸序列如SEQ ID NO.2所示，得到慢病毒载体pSLenti‑U6‑miR30(mmu‑miR‑29a‑3p)‑hSyn‑mNeonGreen，能够有效提高小鼠原代神经元的感染能力，增强目的基因转导效率，实现目的基因长期、稳定表达。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，它涉及一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体及构建方法。

背景技术

原代细胞(primary cell)是指从机体的组织(如人组织、小鼠组织、大鼠组织和兔组织等)经蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。在人工条件下使其原代细胞生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。然而，目前尚未有转染小鼠原代神经元的慢病毒载体。

因此，如何研究设计一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体及构建方法是我们目前急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体及构建方法，能够有效提高小鼠原代神经元的感染能力，增强目的基因转导效率，实现目的基因长期、稳定表达。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，提供了一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体，包括基因元件组成的基因片段，所述基因元件按以下顺序顺次连接：U6启动子、miR30(mmu-miR-29a-3p)基因、hSyn启动子、mNeonGreen标记基因。

优选的，所述hSyn-mNeonGreen基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述miR30(mmu-miR-29a-3p)基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第二方面，提供了一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)将慢病毒载体pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-2A-Puro中的CMV-EGFP-2A-Puro基因元件替换为hSyn-mNeonGreen基因，得到载体pSLenti-U6-shRNA-hSyn-mNeonGreen，hSyn-mNeonGreen基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将慢病毒载体pSLenti-U6-shRNA-hSyn-mNeonGreen中的shRNA基因替换为miR30(mmu-miR-29a-3p)基因，得到慢病毒载体pSLenti-U6-miR30(mmu-miR-29a-3p)-hSyn-mNeonGreen，miR30核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，在步骤(1)中，将SEQ ID NO.1所示的hSyn-mNeonGreen基因插入到pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-2A-Puro中的上游克隆酶切位点EcoRI、下游克隆酶切位点SpeI之间，基因大小为1199bp。