[发明专利]间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域。本发明体外分离、培养骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和皮肤间充质干细胞，通过超速离心法提取细胞培养上清中的外泌体，通过关节腔给药方式给药。三种来源间充质干细胞的外泌体可显著缓解老年性膝关节磨损大鼠的相关指征，如改善老年性膝关节磨损模型小鼠的Mankin评分，抑制炎症因子以及激活RANK系统。

技术领域

本发明涉及一种间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

根据世界卫生组织(WHO)的统计数据，全球大约有3.55亿骨关节炎患者，这是一种进行性和使人衰弱的关节疾病，预计到2040年将影响高达25％的人口。膝关节是人体最大最复杂的关节，承受人体60％的重量，因此膝关节极易受到磨损、损伤，最早、最主要的病理改变在关节软骨，软骨几乎没有再生能力，疾病发生后，随着年龄的增长，其病理学改变不可逆转，严重可引起膝关节骨性关节炎。膝关节骨性关节炎的发病人群中多为老年人，据统计，65岁以上人群中发病率为60％，75岁以上人群中高达80％。这可能与老人血液循环慢，骨关节老化以及膝部活动量过少等原因有关。膝关节骨性关节炎是严重影响老年人生活质量的一种常见的慢性退行性疾病，主要表现为膝关节僵硬、肿胀、疼痛、活动受限、行走困难，甚至长期卧床者可出现膝关节的挛缩、肌肉萎缩等。膝关节骨性关节炎目前只能通过药物来改善症状，严重的骨性关节炎的老年患者常需要接受手术治疗，目前人工全膝关节置换术已成为治疗各种膝关节晚期病变的主要手段，但术后仍然可能出现不同程度的并发症。目前还没有一种令人满意的治疗策略可以彻底治愈老年性膝关节骨性关节炎。因此，进一步深入研究老年性膝关节骨性关节炎发生、发展的分子机制，寻找新型治疗老年性膝关节骨性关节炎的治疗手段具有十分重要的科学意义和临床应用价值。

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官的潜在功能，可以对病变、衰老、损伤的组织器官进行修复和替代，是未来医学领域治疗各种疑难杂症的主要来源和手段。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于中胚层，是再生医学理想的种子细胞。间充质干细胞存在于骨髓、胎盘、脐带、脐带血、脂肪、皮肤等多种组织中，尽管胎盘、脐带和脐带血中均可以分离出间充质干细胞，但是其来源受限。而骨髓、脂肪和皮肤组织中也含有大量间充质干细胞，均可来源于自体，不受来源限制，且无排斥反应，因而成了医学研究中的热点。

然而，干细胞治疗存在很多不可忽视的问题，如干细胞本身异常分化、免疫排斥、以及干细胞的长期保存与运输问题等。基于上述原因，寻找替代干细胞的治疗途径显得尤为重要。外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的脂质双分子层的囊性小泡，直径大约为40-150nm，其功能取决于其所来源的细胞类型。囊性小泡内含有多种的蛋白质(如各种酶、脂质、生长因子、细胞因子)和一些编码和非编码RNA，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。目前，越来越多的研究表明，外泌体在疾病的早期诊断以及治疗中发挥着至关重要的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用，间充质干细胞外泌体可显著缓解老年性膝关节磨损患者的相关指征，如改善老年性膝关节磨损模型小鼠的Mankin评分，抑制炎症因子以及激活RANK系统。

为解决上述技术问题，本发明提供一种间充质干细胞外泌体的制备方法，包括：体外分离、培养间充质干细胞，采用超速离心法提取细胞培养液上清中的外泌体，所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、皮肤表皮间充质干细胞及脂肪间充质干细胞。

优选地，所述骨髓间充质干细胞的分离与培养方法包括：