[发明专利]间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用

权利要求书

1.间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征是，包括：体外分离、培养间充质干细胞，采用超速离心法提取细胞培养液上清中的外泌体，所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、皮肤表皮间充质干细胞及脂肪间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征是，所述骨髓间充质干细胞的分离与培养方法包括：

取大鼠双侧股骨和胫骨，用含10％FBS的DMEM/F-12培养液冲洗出骨髓置于培养皿中，过滤；将过滤液离心，弃上清液后用含10％FBS的DMEM/F-12培养液重悬细胞，置于细胞培养箱进行培养；3天后首次换液，此后隔天换液一次，待细胞长满瓶底时按照1：2比例传代；流式细胞仪分析筛选，获得骨髄间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征是，所述脂肪间充质干细胞的分离与培养方法包括：

将手术取下的皮下脂肪组织，用PBS溶液冲洗以去除杂质，将提取的脂肪组织剪碎后移至螺口注射器中，接上脂肪乳化器，反复推注以破碎脂肪组织，然后过滤获得脂肪间充质干细胞悬液；离心、弃上清，加入含10％FBS的DMEM培养基重悬后，接种于培养瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；24h后更换培养基，去除未贴壁细胞，以后每隔两天更换1次培养基，待其融合度达到80-90％，胰酶消化，以1：3的比例进行传代；流式细胞仪检测细胞表型，获得脂肪干细胞。

4.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征是，所述皮肤表皮间充质干细胞的分离与培养方法包括：

将手术取下的新鲜皮肤组织，在无菌条件下用含有双抗的PBS清洗并浸泡，分离出表皮并将表皮切成碎片，加入含0.02％EDTA的0.05％重组胰蛋白酶，37℃消化30min，用含10％FBS的培养基终止消化，过滤悬浮细胞获得单细胞悬液；离心后，用KSFM培养基重悬细胞，接种于IV胶原包被的培养瓶中培养10min，将上层未贴壁细胞吸去，加入KSFM培养基继续培养，隔日换液，待其融合度达到80-90％，胰酶消化，以1：3的比例进行传代；流式细胞仪分析筛选，获得皮肤表皮间充质干细胞。

5.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征是，提取细胞培养液上清中的外泌体的具体方法为：

将干细胞培养液过滤，滤液进行高速梯度离心，首先是在4℃下，300g离心10min，取上清；2000g离心30min，取上清；10000g离心30min，取上清；140000g离心120min，弃上清，所获沉淀即为间充质干细胞分泌的外泌体；然后，用预冷的PBS重悬和清洗获得的外泌体，再次超速离心140000g离心120min；最后，用50μl 4℃的PBS重悬后转移到低粘附管中，得到外泌体。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法制备得到的间充质干细胞外泌体。

7.根据权利要求6所述的间充质干细胞外泌体在制备治疗老年性膝关节磨损药物中的应用。

8.一种药物，其特征是，含有权利要求6所述的间充质干细胞外泌体。