[发明专利]表达目的蛋白分布于丝素和丝胶的家蚕丝心蛋白重链表达系统及制备方法和应用

说明书

本发明公开了用于丝素和丝胶表达目的蛋白的家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用，表达系统含有5’端为丝心蛋白重链启动子3；3’端为重链基因poly(A)序列的表达框，利用该系统表达外源蛋白，通过对转基因家蚕的鉴定及检测分析，发现在丝腺及茧丝中均检测到EGFP的存在，并且在茧丝中丝胶层也有分布，表明在C端不存在的情况下，N端对于蚕丝的形成不是必须的因素，且C端的缺失能够使蛋白分布于丝胶层。丝素N端的解析为蚕丝的成丝机理提供了实验及理论基础，有利于创造真正实用的家蚕丝腺生物反应器，保持蚕丝产业可持续发展，促进我国蚕学和昆虫学科的长远发展。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及表达目的蛋白分布于丝素和丝胶的家蚕丝心蛋白重 链表达系统；还涉及该系统的制备方法和应用。

背景技术

家蚕茧丝的主要组成是丝素(fibroin)和丝胶(sericin)两种蛋白，其中丝素是茧丝的主 要成分，约占茧丝重的82％。丝素由家蚕的后部丝腺(PSG)细胞合成，丝胶由中部丝腺(MSG) 细胞合成，它们都在中部丝腺聚集，最后经过前部丝腺(ASG)被榨丝后而吐丝结茧。丝素 由350-kDa的重链蛋白(H-chain)，26-kDa的轻链蛋白(L-chain)和30-kDa的fibrohexamerin/P25(fhx)三种蛋白构成。这些蛋白在后部丝腺细胞内首先按照一定的比例 (H-chain：L-chain：fhx＝6：6：1)形成丝素基本单元，然后丝素基本单位被分泌到丝腺腔。 其中丝素基本单位由6个通过二硫键结合的重链、轻链(H-L)二聚体和1个P25糖蛋白分子组成。H-L二聚体在Fib-L的Cys-172和Fib-H的Cys-c20之间形成二硫键。一个P25糖蛋 白和六个H-L二聚体通过与重链的N端结构域(NTD)的非共价相互作用在内质网上形成丝 素基本单元。在丝素基本单位中重链蛋白是最主要的成分，达92％，并且是茧丝具有优良机械性能的原因所在，而轻链蛋白只占约7％，fhx约占1％。而丝素重链是由中间的12个结晶区域、11个非结晶区域和两端保守亲水的N端结构域(NTD)和C端结构域(CTD)组成。

自从家蚕基因组框架图由中国家蚕基因组计划研究小组领导的率先完成后，它不但确立 了我国家蚕功能基因组研究在国际上的地位，而且也为蚕丝业和昆虫学科的发展提供了新的 契机。功能基因组时期的主要工作包括：主要功能基因的鉴定克隆，重要生物学性状的分子 机理的阐明，最终实现重要经济性状的人为调节和创造。家蚕最重要的性状是家蚕的丝腺能 在短时间高效地大量合成绢丝蛋白。利用家蚕丝腺的这一特点，在丝腺中高效表达外源蛋白 一直是许多蚕学和生物学科技工作者追求的目标。而目前对于成丝机理的研究仍有很多细节 需要科研工作者去解析，特别是在茧丝中占比最大且主要负责蚕丝机械性能的丝素重链其各 元件在丝形成过程中发挥着怎样的作用更加需要进一步探究。

利用鳞翅目来源的转座子piggyBac的家蚕胚胎显微注射转基因技术最初在日本取得成 功，而经过科研工作者的努力，我们也建立了系统而完善的家蚕胚胎显微注射转基因技术， 为本研究的工作开展打下了良好的基础。在利用转座子piggyBac的家蚕胚胎显微注射转基因 技术的研究报道中，已有关于丝素重链完整N端及完整C端(LBS)的报道，而有关利用家 蚕丝素重链表达系统(N端完整，无C端)表达外源蛋白的方法未见报道，这也将进一步探 究了丝素重链元件N、C端的作用，为蚕丝成丝机理的研究提供实验及理论基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供表达目的蛋白分布于丝素和丝胶的家蚕丝心蛋白重链 表达系统；本发明的目的之二在于提供含有所述家蚕丝心蛋白重链表达系统的重组载体；本 发明的目的之三在于提供所述重组载体的制备方法；本发明的目的之四在于提供所述家蚕丝 心蛋白重链表达系统或所述重组载体在丝素和丝胶表达目的蛋白中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：