[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体及其应用

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体，该载体包含由proC启动子调控的LbCas12a蛋白编码框核酸序列、J23100启动子调控的crRNA表达框核酸序列、包含大肠杆菌复制因子CloDF13、壮观霉素耐受基因SMR和负责调控LbCas12a蛋白表达的proC启动子元件的质粒骨架核酸序列。本发明还公开了该载体的构建方法及其在噬菌体基因组编辑中的应用。很多噬菌体通过对自身基因组DNA进行共价化学修饰(如T4噬菌体基因组中的胞嘧啶被高度糖基化修饰)以耐受宿主核酸酶对其基因组的切割，噬菌体的这种自我保护机制给基因组编辑带来了很大障碍，本发明克服了噬菌体基因组共价修饰的限制，实现了对噬菌体基因组的高效编辑。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体，其构建方法和应用。

背景技术

噬菌体无论从数量上还是种类上都被认为是地球上最丰富的物种，蕴藏着丰富的生物宝藏。近年来，噬菌体作为天然的生物材料已经被用于疫苗载体、基因治疗载体、细菌检测、耐药菌治疗、组织再生、能量电池等等。然而，野生型噬菌体往往不能满足各种研发需求，对噬菌体进行改造是上述研究的基本前提。传统的噬菌体基因组编辑方法效率低、操作费时、工作量大，极大的限制了噬菌体的相关研究。为此，科学家们用CRISPR-Cas系统开发了新型噬菌体基因组编辑技术。

CRISPR-Cas是细菌和古细菌的获得性免疫系统，能特异性地识别并切割噬菌体的基因组DNA，从而抵御噬菌体的侵袭。目前已经发现6种类型CRISPR-Cas系统，其中II型(CRISPR-Cas9)和V型(CRISPR-Cas12a)系统结构较为简单。基于CRISPR-Cas9的噬菌体基因组编辑技术利用crRNA来引导SpCas9核酸酶特异地识别和切割噬菌体的基因组，产生的双链DNA切口通过同源重组与含有预期突变的供体质粒交换片段，从而将预期突变引入到噬菌体的基因组中。使用该方法可以对噬菌体的基因组进行缺失、插入和替换等操作。

限制-修饰系统是细菌抵御噬菌体感染的另一道防线，它利用细菌的核酸酶切割噬菌体的基因组，而细菌自身基因组DNA通过共价修饰免受核酸酶的切割。为了抵抗细菌的限制-修饰系统，噬菌体也对自身的基因组DNA进行共价化学修饰，如T4噬菌体基因组中的胞嘧啶被高度糖基化修饰。研究表明噬菌体基因组的共价化学修饰同样耐受Cas9的切割，这也极大地限制了CRISPR-Cas9噬菌体编辑的应用。因此，开发一种高效、便捷的噬菌体基因组编辑方法将会极大促进人类探寻噬菌体生物宝藏的效率，对疫苗、耐药菌治疗、细菌检测、基因治疗、组织再生、能量电池等生物医学及相关领域的研究具有很大的促进作用。

发明内容

本发明的第一个目的是开发一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体，旨在克服传统噬菌体基因组编辑和CRISCR-Cas9噬菌体编辑技术的缺陷，能够高效、便捷地对噬菌体基因组进行编辑。

本发明的第二个目的是提供一种构建所述噬菌体基因组编辑载体的方法。

本发明的第三个目的是提供一种噬菌体基因组编辑载体的工程菌。

本发明的第四个目的是提供所述的噬菌体基因组编辑载体、以及所述的工程菌在编辑噬菌体基因组中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种编辑噬菌体基因组的方法。

为实现第一个目的，本发明利用来源于毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)的V型CRISPR-Cas系统(LbCas12a)开发了一种高效、便捷的噬菌体编辑载体pLbCas12a，该载体包含由proC启动子调控的来源于毛螺科菌的LbCas12a蛋白编码框核酸序列、J23100启动子调控的crRNA表达框核酸序列、包含复制因子、耐受基因和负责调控LbCas12a蛋白表达的proC启动子元件的质粒骨架核酸序列。

所述复制因子是大肠杆菌复制因子CloDF13。