[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体及其应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体，包含由proC启动子调控的毛螺科菌LbCas12a蛋白编码框核酸序列、由J23100启动子调控的crRNA表达框核酸序列、包含复制因子、耐受基因和负责调控LbCas12a蛋白表达的proC启动子元件的质粒骨架核酸序列，所述噬菌体基因组编辑载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中：

所述由proC启动子调控的毛螺科菌LbCas12a蛋白编码框核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述由J23100启动子调控的crRNA表达框核酸序列如SEQ ID NO.2所示；

包含复制因子、耐受基因和负责调控LbCas12a蛋白表达的proC启动子元件的质粒骨架核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的噬菌体基因组编辑载体，其特征在于：所述复制因子是大肠杆菌复制因子CloDF13。

3.如权利要求1所述的噬菌体基因组编辑载体，其特征在于：所述耐受基因是壮观霉素耐受基因SMR。

4.一种构建权利要求1-3任何一项所述噬菌体基因组编辑载体的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）以pET28b-NLS-LbCpF1质粒为模板，PCR扩增得到由proC启动子调控的LbCas12a蛋白编码框核酸序列，该序列如SEQ ID NO.1所示；

2）以DS-SPCas质粒为模板，PCR扩增得到J23100启动子调控的crRNA表达框核酸序列，该序列如SEQ ID NO.2所示；

3）以DS-SPCas质粒为模板，PCR扩增得到包含复制因子、耐受基因和proC启动子元件的质粒骨架核酸序列，该序列如SEQ ID NO.3所示；

4）通过克隆方法将上述三种核酸序列片段连接在一起，得到核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示的噬菌体基因组编辑载体。

5.含有权利要求1-3任何一项所述噬菌体基因组编辑载体的工程菌。

6.权利要求1-3任何一项所述的噬菌体基因组编辑载体、权利要求5所述的工程菌在编辑噬菌体基因组中的应用。

7.一种编辑噬菌体基因组的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将噬菌体靶向目标区域的Spacer序列克隆到权利要求1-3任何一项所述的噬菌体基因组编辑载体；

2）在线性化载体的DNA片段上拼接噬菌体突变区域和上下游同源臂，构建含有预期突变的供体质粒；

3）将1）和2）中构建的质粒共转化到宿主菌；

4）用噬菌体感染含有上述两种质粒的宿主菌，得到的重组噬菌体。

8.如权利要求7所述编辑噬菌体基因组的方法，其特征在于：所述噬菌体为T4噬菌体。

9.如权利要求7所述编辑噬菌体基因组的方法，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌。