[发明专利]一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒，涉及免疫检测技术领域。本发明利用独属于艰难梭菌的抗原表位TcdB1和TcdB2作为抗原决定簇，利用单个抗原表位连接钥孔血蓝蛋白后免疫实验兔，得到高纯度、高效价及高特异性的多克隆抗体。本发明基于所述多克隆抗体提供了一种双抗体夹心ELISA试剂盒用于检测艰难梭菌，所建立的检测方法更为科学、严谨；同时满足ELISA试剂对灵敏度、特异性、重复性等重要参数的要求。

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒。

背景技术

艰难梭菌(Clostridium diffcile，CD)为革兰阳性粗大杆菌，有鞭毛，有芽孢的专性厌氧菌，分离培养较为困难。艰难梭菌感染大多数为无症状携带者，临床上艰难梭菌感染(Clostridium diffcile infection，CDI)，可引起轻度腹泻至血样腹泻，严重感染患者可导致假膜性结肠炎、中毒性巨结肠、肠坏死，甚至危及生命。艰难梭菌主要产生两种毒素：肠毒素(TcdA)和细胞毒素(TcdB)。肠毒素能趋化中性粒细胞浸润回肠肠壁，释放细胞因子，导致肠道大量失水和出血性坏死。细胞毒素能解聚肌动蛋白，损坏细胞骨架，导致局部肠壁细胞坏死，有直接损伤肠壁作用。近些年发现了TcdB也具有肠毒素的功能，可单独致病。

艰难梭菌的实验室检测是临床诊断CDI的重要依据，但目前国内缺乏标准的艰难梭菌毒素的检测方案，且相关研究较少，使艰难梭菌临床资料匮乏。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒，从而建立一套完整的艰难梭菌的检测方法，更为科学、严谨，具有检测灵敏度高、特异性行和重复性好等优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种艰难梭菌抗原，所述抗原包括将抗原表位TcdB1和TcdB2分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白KLH连接形成的抗原；所述TcdB1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述TcdB2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，在所述连接前，还包括分别在所述TcdB1和TcdB2的氨基酸序列的N端添加1个半胱氨酸修饰。

本发明还提供了一种艰难梭菌的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：每隔两周对新西兰兔进行一次免疫，在第5次免疫2周后，从血液中分离纯化蛋白，得多克隆抗体Anti-TcdB1或Anti-TcdB2；

第一次免疫时，利用所述抗原分别单独与弗氏完全佐剂等体积混匀，乳化后得首次免疫抗原，利用所述的首次免疫抗原免疫兔；

第二次至第四次免疫时，利用所述抗原分别单独与弗氏不完全佐剂等体积混匀，乳化后得第二免疫抗原，利用所述第二免疫抗原免疫所述兔；

第五次免疫时，利用所述抗原免疫所述兔。

优选的，在第一次免疫时，在兔腋下、颈部和背部共5处分别注射所述第一免疫抗原0.1mg；

在第二次至第四次免疫时，在第一次免疫的相同位置分别注射所述第二免疫抗原0.1mg；

在第五次免疫时，经耳缘静脉注射所述抗原0.1mg。

优选的，在每次免疫后1周还包括采集血清，用间接ELISA方法测定血清抗体效价并进行Western-blot验证抗体的特异性。

优选的，所述分离纯化，包括将心脏血经4000r/min分离血清，用0.45μm滤器过滤后通过proteinA亲和层析柱分离纯化。