[发明专利]一种艰难梭菌抗原及多克隆抗体的制备方法和检测试剂盒

权利要求书

1.一种艰难梭菌抗原，其特征在于，所述抗原包括将抗原表位TcdB1和TcdB2分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白KLH连接形成的抗原；所述TcdB1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述TcdB2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述抗原，其特征在于，在所述连接前，还包括分别在所述TcdB1和TcdB2的氨基酸序列的N端添加1个半胱氨酸修饰。

3.一种艰难梭菌的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：每隔两周对新西兰兔进行一次免疫，在第5次免疫2周后，从血液中分离纯化蛋白，得多克隆抗体Anti-TcdB1或Anti-TcdB2；

第一次免疫时，利用权利要求1或2所述抗原分别单独与弗氏完全佐剂等体积混匀，乳化后得首次免疫抗原，利用所述的首次免疫抗原免疫兔；

第二次至第四次免疫时，利用权利要求1或2所述抗原分别单独与弗氏不完全佐剂等体积混匀，乳化后得第二免疫抗原，利用所述第二免疫抗原免疫所述兔；

第五次免疫时，利用权利要求1或2所述抗原免疫所述兔。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，在第一次免疫时，在兔腋下、颈部和背部共5处分别注射所述第一免疫抗原0.1mg；

在第二次至第四次免疫时，在第一次免疫的相同位置分别注射所述第二免疫抗原0.1mg；

在第五次免疫时，经耳缘静脉注射权利要求1或2所述抗原0.1mg。

5.根据权利要求3或4所述制备方法，其特征在于，在每次免疫后1周还包括采集血清，用间接ELISA方法测定血清抗体效价并进行Western-blot验证抗体的特异性。

6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述分离纯化，包括将心脏血经4000r/min分离血清，用0.45μm滤器过滤后通过proteinA亲和层析柱分离纯化。

7.一种人艰难梭菌TcdB双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下成分：96孔板、PBS缓冲液、PBST缓冲液、包被液、封闭液、抗体稀释液显色液、终止液和抗体，所述抗体包括一抗和二抗，所述一抗为利用权利要求3～6任一项所述制备方法制备得到的Anti-TcdB1，所述二抗为HRP标记的利用权利要求3～6任一项所述制备方法制备得到的Anti-TcdB2。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，利用所述试剂盒检测人艰难梭菌前，包括对所述96孔板进行预处理，所述预处理包括：利用所述包被液将Anti-TcdB1稀释至0.5μg/ml，100μl/孔加至96孔板，37℃包被2小时后，转4℃包被8～12h；包被后用所述PBST缓冲液洗板三次；向包被后的板内每孔加入300μl封闭液，置于37℃封闭2小时后，转移至4℃继续封闭8～12h；封闭后用所述PBST缓冲液洗板三次，干燥。

9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述包被液包括摩尔浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH值为9.6。

10.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述抗体稀释液为含BSA的PBST缓冲液，所述BSA和PBST的质量体积比为0.2g：100mL。