[发明专利]一种催化活性提高的酮还原酶突变体及其应用

说明书

本发明实施例公开了一种催化活性提高的酮还原酶突变体及其应用，属于生物催化方法及应用技术领域，所述酮还原酶突变体源于Starmerella magnoliae的野生型酮还原酶，能将3S‑1‑氯‑3‑叔丁氧羰基氨基‑4‑苯基‑2‑丁酮转化生成(2S,3S)‑1‑氯‑3‑叔‑丁氧羰基氨基‑4‑苯基‑2‑丁醇，与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，与SEQ ID NO.8具有90％以上相似性且具有以下特征中的一个或多个突变：I54E,S85A,K182V，该酮还原酶突变体的序列为SEQ ID NO.6。本发明使用醇类用于辅酶循环，底物浓度高达110g/L，底物用量/NADP用量高达1100:1，辅酶循环次数高，有效的扩大了下游应用范围。

技术领域

本发明属于生物催化方法及应用技术领域，尤其涉及一种催化活性提高的酮还原酶突变体及其应用。

背景技术

达芦那韦，又名地瑞那韦，以商品名Prezista出售，是强生公司的一种用于非肽类艾滋病毒蛋白酶抑制剂，美国食品药品管理局(FDA)在2006年批准其上市。2011年美国食品药品管理局(FDA)宣布批准Prezista(达如那韦)的口服混悬液制剂。是全球第二个上市的非肽类蛋白酶抑制剂，是目前世界上主要的抗艾滋病药物之一。

(2S,3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇做为制备达芦那韦的关键中间体，目前主要生产工艺有化学合成法和生物法两种，其中生物法可由相应的酮还原酶或微生物全细胞生物转化3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮获得。

酮还原酶是一种多用途催化剂，通过醛或酮的对映体选择性还原成对应醇。(R)特异性酮还原酶与(S)特异性酮还原酶具有不同特性，并且这些催化剂在光学活性醇的工业合成中被越来越频繁地用到。旋光性是许多医药和农药活性化合物选择性作用的必要条件，在一些情况下，一个对映体具有有益的药物活性，另一个对映体却具有基因毒性作用。因此，在药用和农药用活性化合物的合成中，需要使用具有所要求的立体特异性的催化剂合成光学活性醇。

公开报道显示巴西Amanda等人用生物法制备(2S,3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(DOI:10.1002/cctc.201403023)，其利用一种Ralstonia sp.来源的RasADH，不对称地还原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生(2S,3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇。该方法使用了辅酶NADPH，市场价格昂贵，一定程度上限制了其应用。其底物浓度为10mg/ml折合10g/L且光学纯度仅为90％，无法满足相关医药中间体的制备需求。

专利文件JP4746548B2最早提出用生物法制备(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，该专利利用一种新型的羰基還元酵素，不对称地还原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇。该专利同时在中国申请保护并在2011年取得授权(CN1993464B)。后续其他公司如美国Codexis等在酶种类、反应条件、以及辅酶循环等条件进行优化提升，进一步提高生产效率，以期降低条件要求及成本(US8796002)。目前，(2R,3S)醇已可通过酮还原酶突变体实现产业化放大(不低于100g/L底物)，但尚无报道对(2S,3S)醇的工业化生产。

另有多种报道尝试利用微生物来源的酮基还原酶制备(2R,3S)或(2S,3S)化合物，如Candida gropengoesseri，Candida sp.，Candida vaccinii，Candida geochares等来源的酮基还原酶。但仍存在低光学纯度(50％-70％)或低转化率等问题，不具有实际生产前景。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中(2S,3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇酶催化制备过程中酶活低，转化效率低的技术问题。提供一种用于生产达芦那韦中间体的酮还原酶突变体法，技术方案如下：