[发明专利]人源降钙素原的单克隆抗体其制备方法和用途

说明书

本发明涉及与人源降钙素原蛋白特异性结合的单克隆抗体。具体地，该单克隆抗体可以特异地、高效地识别人源降钙素原的蛋白。本发明提供了分泌该单克隆抗体的保藏号为CGMCC No.10417的杂交瘤细胞系，其能够稳定分泌高效价的抗降钙素原的单克隆抗体。此外，本发明还涉及一种以降钙素原突变抗原为免疫原制备抗降钙素原抗体的方法。另外，本发明还涉及上述单克隆抗体在制备检测或者定量降钙素原或其片段的免疫检测试剂的用途，该单克隆抗体可以应用于疾病的诊断或者相关领域。

技术领域

本发明涉及医学诊断领域。具体地，本发明涉及一种可以产生特异针对人源降钙素原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其制备方法。该杂交瘤制备的单克隆抗体可以应用于疾病的诊断或者相关领域。

背景技术

降钙素原(procalcitonin，PCT)是二十世纪九十年代才发现的细菌、真菌性感染的特异性标志物，是一种无激素活性的降钙素前肽，由116个氨基酸组成，分子量大约为13KD。它可以在酶的作用下逐步裂解成57个氨基酸的氨基降钙素原(N-PCT)、32个氨基酸的降钙素(calcitonin，CT)和21个氨基酸的降钙蛋白。降钙素原是11号染色体上降钙素I基因(CALC-I)的表达产物。在不存在感染的情况下，甲状腺外CALC-I表达被抑制，而主要局限于甲状腺和肺的神经内分泌细胞一定程度的表达；细菌感染诱导全身各种组织多种细胞类型的CALC-I表达和降钙素原连续性释放。近年来研究表明在严重全身性细菌、真菌、寄生虫、急性疟疾感染、全身性炎症反应综合征(SIRS)、多器官功能衰竭综合征(MODS)的诊断方面，降钙素原是一个具有高灵敏度、特异性的新指标。

降钙素原一共116个氨基酸，其根据结构域和功能可以分为三段。1-57位为其N段。在体内N端会在57位开始被剪切，生成含有降钙素的60-116位氨基酸。同时，在91位也会被蛋白酶剪切，形成降钙素和抗钙素原(96-116位氨基酸的katacalcin)。因此在人血清中存在着降钙素原整体以及其多种剪切后的片段，而这些片段在人体内发挥着与降钙素原不一样的生理功能。

为了特异地、准确地诊断识别出完整的降钙素原的片段，目前有三种方案来测定降钙素原的含量。第一种，选择抗1-57片段的多抗来进行降钙素原的测定。第二种，选择抗1-57片段的单抗和抗60-116片段的单抗进行夹心测定。第三种，选择抗N段和降钙素结合的区域的单抗和抗60-116片段的单抗进行夹心测定。

由于降钙素原的N末端不稳定，容易降解，因而以纯人源降钙素原抗原进行免疫时，不稳定的抗原会产生较弱的免疫应答，达不到高效抗体的制备条件。因此，现有技术中存在解决纯人源降钙素原抗原进行免疫时由于不稳定的抗原会产生较弱的免疫应答的问题的需要。

发明内容

为了解决纯人源降钙素原抗原进行免疫时由于不稳定的抗原会产生较弱的免疫应答的问题，本发明旨在提供在制备与人源降钙素原蛋白特异性结合的单克隆抗体及其制备方法。发明人通过突变1-57个氨基酸中的个别氨基酸，主要是针对19-40位的个别氨基酸，并体外重组表达这种突变的蛋白。发明人发现上述处理可以改善降钙素原蛋白的稳定性，使其在与佐剂共同乳化后注射入动物体内不容易降解，从而产生更加高效的抗体。发明人发现最终表位分析确定为20-35位的氨基酸。

本发明提供了一种与人源降钙素原特异性结合的抗降钙素原抗体，其中所述抗降钙素原抗体与保藏号为CGMCC No.10417的杂交瘤细胞系产生的降钙素原单克隆抗体特异性结合相同的降钙素原表位。

在本发明的一个方面，所述抗降钙素原抗体包含保藏号为CGMCC No.10417的杂交瘤细胞系产生的降钙素原单克隆抗体的人源化序列。

在本发明的另一个方面，所述抗降钙素原抗体是单克隆抗体。

在本发明的又一个方面，所述抗降钙素原抗体特异性结合具有氨基酸序列为RLLLAALVQDYV(SEQ ID NO:1)的表位。