[发明专利]一种利用流式细胞术快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法

说明书

本发明提供了一种利用流式细胞术快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法，包括如下步骤：将食用菌原生质体细胞过滤后，加入CFSE荧光染料染色作为样本，或加入等量的二甲基亚砜染色作为阴性对照；然后利用含有488nm激光器的流式细胞仪对染色的原生质体细胞进行分析，在FSC/SSC散点图上设置FSC阈值为50，调整FSC和SSC的电压，在此图圈出目的细胞群（P1门）；绘制散点图FL1/SSC，用阴性对照管确定阴性细胞群位置，在FL1/SSC散点图上FL1横坐标10²以外位置全部圈出设为P2门。P1门内的是总原生质体细胞，P2门内的为有活力的原生质体细胞。本发明的检测方法能够在段时间内快速准确获得有活力的原生质体数量，为食用菌原生质体的制备和再生提供了快速有效的方法。

技术领域

本发明属于食用菌育种技术领域，具体涉及一种利用流式细胞仪快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法。

背景技术

目前我国缺乏适合工厂化栽培的食用菌品种，对食用菌生长栽培的发育机制等也知之甚少，因此食用菌的遗传育种和分子机制的研究就显得尤为迫切。

由于食用菌是真菌，外层有坚硬的细胞壁包裹，对其进行遗传操作和分子改造都离不开原生质体的制备。获得有活力的原生质体并对其进行准确的计数对于食用菌的遗传育种和分子机制研究具有重要的参考价值。

传统的原生质体的计数方法为血球计数法，该方法存在较大误差，且无法区分有活力的原生质体和没有活力的原生质体。流式细胞术作为一种高效的计数手段，最先被应用在微生物技术领域，随后在细胞免疫学领域得到广泛应用。流式细胞仪检测的是荧光信号，因此需要对细胞进行染色才能对其进行检测。而目前常用的染料中PI染液只能对死细胞进行染色，并不能对活细胞直接进行检测，且检测结果可能存在较大的偏差；SYBR GreenI和SYT90染液虽能够对活细胞直接进行染色，但染液对会影响原生质体的活力，进而影响原生质体的再生率。

不同种类食用菌原生质体细胞的大小差别较大，如羊肚菌的细胞较大，直径在9.16～13.2μm，长根菇的原生质体细胞为5.90～7.18μm，真姬菇的原生质体细胞则较小，直径为2.10±5.02μm；而且在食用菌原生质体制备过程发现，同一材料的原生质体细胞的大小也存在差异。细胞大小的差异对于原生质体的计数也会产生一定的影响。因此，非常需要一种能够不受各种因素影响并快速检测有活力的食用菌原生质体细胞数量的方法。

发明内容

本发明提供了一种利用流式细胞术快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法，该方法操作简单、效率高、检测准确，所使用CFSE染料不影响食用菌原生质体细胞的活力和再生率。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种利用流式细胞仪快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法，步骤如下：

(1)样本制备与染色：食用菌酶解得到的食用菌原生质体细胞经筛网过滤后，加入CFSE荧光染液染色，得到染色的食用菌原生质体细胞；

(2)流式细胞术的分析与测定：

a、使用流式细胞仪进行分析：将染色的食用菌原生质体细胞放入流式细胞仪中，分别绘制FSC/SSC散点图和FL1/SSC散点图；设置FSC/SSC散点图的 FSC阈值为50以去除食用菌原生质体细胞碎片，调整FSC和SSC的电压使染色的食用菌原生质体细胞团完全显示并位于图片中央位置，然后设P1门将上述细胞团完全圈出，P1门内显示的细胞是总食用菌原生质体细胞；在FL1/SSC散点图上显示P1门内的食用菌原生质体细胞，然后在FL1/SSC散点图上将FL1信号大于10²的细胞圈门(P2门)，P2门内显示的的细胞是有活力的食用菌原生质体细胞；

b、根据流式细胞仪的流速和收集时间计算食用菌原生质体细胞浓度；