[发明专利]一种利用流式细胞术快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法

权利要求书

1.一种利用流式细胞术快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）样本制备与染色：食用菌酶解得到的食用菌原生质体细胞经筛网过滤后，加入CFSE荧光染液染色，得到染色的食用菌原生质体细胞；

（2）流式细胞术的分析与测定：

a、使用流式细胞仪进行分析：将染色的食用菌原生质体细胞放入流式细胞仪中，分别绘制FSC/SSC散点图和FL1/SSC散点图；设置FSC/SSC散点图的FSC阈值为50以去除食用菌原生质体细胞碎片，调整FSC和SSC的电压使染色的食用菌原生质体细胞团完全显示并位于图片中央位置，然后设P1门将这些细胞团完全圈出，P1门内显示的细胞是总食用菌原生质体细胞；在FL1/SSC散点图上显示P1门内的食用菌原生质体细胞，然后在FL1/SSC散点图上将FL1信号大于10²的细胞圈门设为P2门，P2门内显示的是有活力的食用菌原生质体细胞；

b、根据流式细胞仪的流速和收集时间计算食用菌原生质体细胞浓度；

c、统计P2门内食用菌原生质体细胞总数和P1门内食用菌原生质体细胞总数，计算食用菌原生质体活力率。

2.根据权利要求1所述的一种利用流式细胞术快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法，其特征在于，所述步骤（1）中筛网为200目。

3.根据权利要求1所述的一种利用流式细胞术快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法，其特征在于，所述步骤（1）中CFSE荧光染液的添加量为1% v/v。

4.根据权利要求1所述的一种利用流式细胞术快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法，其特征在于，所述步骤（1）中CFSE荧光染液的染色条件为室温、避光，染色时间为5-10分钟。

5.根据权利要求1所述的一种利用流式细胞术快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法，其特征在于，所述步骤（1）中得到的食用菌原生质体细胞浓度为1.0×10⁴~1.0×10⁸个/mL。

6.根据权利要求1所述的一种利用流式细胞术快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的流式细胞仪具有488 nm激光器。

7.根据权利要求1所述的一种利用流式细胞术快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法，其特征在于，所述方法中设置阴性对照，即在食用菌原生质体细胞中加入等量的1%v/v的二甲基亚砜，室温避光放置5-10分钟。

8.根据权利要求7所述的一种利用流式细胞术快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法，其特征在于，所述步骤（2）中在设置所述P2门前，用阴性对照管将阴性对照原生质体细胞群调整到FL1横坐标的10²以内，然后将FL1/SSC散点图上FL1横坐标10²以外的位置全部圈出设为P2门，此时FL1信号大于10²为阳性信号。

9.根据权利要求1所述的一种利用流式细胞术快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法，其特征在于，所述食用菌原生质体细胞大小为2.1~13.2 μm。

10.根据权利要求1所述的一种利用流式细胞术快速检测有活力的食用菌原生质体数量的方法，其特征在于，所述食用菌原生质体活力率=（P2门内食用菌原生质体细胞总数/P1门内食用菌原生质体细胞总数）×100%。