[发明专利]一种大规模快速生产高纯度高活性慢病毒载体的方法

说明书

本发明属于生物领域，尤其涉及一种大规模快速生产高纯度高活性慢病毒载体的方法。该方法包括：S1：使用滤器对含有慢病毒载体的细胞培养液进行过滤澄清；S2：将S1得到的澄清液进行超滤浓缩和换液，得到浓缩后的慢病毒载体；S3：将S2得到的慢病毒浓缩液添加核酸酶进行消化；S4：将S3消化过的样品上样Capto Core700层析柱，收集第一个吸收峰；S5：将S4收集到的样品进行超滤浓缩和换液，即得到慢病毒载体。该方法采用多模式复合层析相技术的方式，一步纯化工艺即可得到高纯度高活性的慢病毒载体，并符合行业使用质量标准。

技术领域

本发明属于生物领域，尤其涉及一种大规模快速生产高纯度高活性慢病毒载体的方法。

背景技术

病毒载体广泛应用于细胞治疗、基因治疗、病毒疫苗三大领域，其作用是将经过修饰的目的基因导入靶细胞，实现靶细胞表达出目的蛋白，以达到疾病治疗的目的。目前基因运载工具多种多样，包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等，而慢病毒载体的应用非常普遍，特别是在神经科学、血液学、发育生物学、干细胞生物学和转基因等领域的应用也正在迅速兴起。

随着慢病毒载体作为临床治疗剂应用的增加，可扩展的商业化工艺(尤其是纯化)正在被大量的研究和优化，以最大程度地确保产品的质量标准。但在大规模生产制备时，它的生产工艺还不是很成熟，尤其是下游的纯化工艺，去除宿主蛋白、基因组DNA、BSA、核酸酶、内毒素等杂质至关重要。常用的慢病毒载体纯化工艺，主要用到超速离心、密度梯度离心、PEG沉淀、超滤、切向流、离子交换层析等方法，绝大部分常规应用，比如细胞感染和普通动物实验，采用超滤和超速离心方法即可使用。目前大多数商业化制备慢病毒载体的工艺有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析，而两者相结合的纯化工艺是比较通用的组合。分子筛层析的缺点在于上样体积很小，每次只能上样层析柱体积的30％或更低；而离子交换层析的主要缺点在于需要高盐洗脱，慢病毒容易失活，导致整个生产工艺流程的回收率偏低，在10-20％范围。

因此，根据现有的行业生产量和质量标准，我们迫切需要开发出一套新的具有高回收率、高活性和高纯度的，并且可工艺放大和产能稳定等优点的生产工艺，以满足临床研究需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于大规模快速生产高纯度高活性慢病毒载体的方法，克服现有技术的不足之处，该方法采用多模式复合层析相技术的方式，一步纯化工艺即可得到高纯度高活性的慢病毒载体，并符合行业使用质量标准。本发明纯化方法操作方便快捷、成本低廉、回收效率高，可满足工业化大生产需求。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种生产病毒载体的方法，包括：

S1：使用滤器对含有慢病毒载体的细胞培养液进行过滤澄清；

S2：将S1得到的澄清液进行超滤浓缩和换液，得到浓缩后的慢病毒载体；

S3：将S2得到的慢病毒浓缩液添加核酸酶进行消化；

S4：将S3消化过的样品上样Capto Core700层析柱，收集第一个吸收峰；

S5：将S4收集到的样品进行超滤浓缩和换液，即得到慢病毒载体。

应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S1之前、步骤S1和S2之间、步骤S2和S3之间、步骤S3和S4之间、步骤S4和S5之间、步骤S5之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。

优选的，在S1中，使用0.65或0.45μm玻璃纤维滤器进行过滤澄清。

应当理解，上述滤膜的孔径并不限于上述范围，本领域技术人员可以根据需要选择任意合适的滤膜来完成本发明，且均在本发明的保护范围之内。

优选的，在S2中，超滤膜截留分子量是100-500KD。