[发明专利]基于酪氨酸酶催化的细胞膜和细胞壁荧光标记方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于酪氨酸酶催化的细胞膜和细胞壁的荧光标记方法及其应用。该标记方法包括两种方案：(1)酪氨酸酶及带苯酚基团的荧光分子，(2)酪氨酸酶、生物素基酪酰胺和荧光染料接枝的亲和素。这两种方案都能通过共价反应将荧光分子连接至哺乳动物细胞膜上，从而实现细胞膜的荧光标记。此外，该荧光标记策略还能够实现对真菌细胞壁以及斑马鱼胚胎表皮细胞膜的荧光成像。相比已有的细胞膜或细胞壁的荧光标记策略，本发明公开的方法具有染色效果好、修饰效率高、操作简单和生物安全性好等优点。

技术领域

本发明涉及一种基于酪氨酸酶催化的细胞膜和细胞壁的荧光标记方法及其应用，属 于生物技术领域。

背景技术

利用荧光分子对细胞膜进行标记和示踪是揭示细胞膜各种微观结构和生理功能的 基本研究手段。目前，常用的细胞膜修饰策略主要包括静电吸附法、疏水插膜法、代谢标记法以及共价接枝法，其中共价接枝法由于其修饰效率高、修饰稳定和操作简单等优 点受到了广泛的关注。该技术利用细胞表面多种可反应的化学基团(如氨基和羧基)， 在生理环境下将修饰分子通过共价连接的方式引入到细胞膜上。例如，带有琥珀酰亚胺酯的修饰分子能够在pH 7.4的水溶液中与细胞膜蛋白上的氨基发生化学反应，从而实现 细胞膜的荧光标记(Cheng H,Kastrup CJ,Ramanathan R,Siegwart DJ,Ma M,Bogatyrev SR, Xu Q,Whitehead KA,Langer R,Anderson DG.Nanoparticulate cellular patches forcell-mediated tumoritropic delivery.ACS Nano 2010,4,2,625-631)。然而，琥珀酰亚 胺酯极易水解，为相关试剂的保存和实验操作带来了很大的不便。最近，有研究人员利 用三(2-羧乙基)膦对细胞膜进行处理，将细胞膜蛋白中的二硫键还原为巯基，然后通过 马来酰亚胺与巯基的反应将荧光分子标记在细胞膜上(Kim H,Shin K,Park OK,Choi D,Kim HD,Baik S,Lee SH,Kwon SH,Yarema KJ,Hong J,Hyeon T,Hwang NS.General and facilecoating of single cells via mild reduction.J.Am.Chem.Soc.2018,140,1199-1202)。然而，利用三(2-羧乙基)膦对细胞膜进行预处理可能带来潜在的细胞毒性或对细胞膜上蛋白结构及功能产生影响。因此，开发一种简单、高效、安全的新型细胞膜共价荧光标 记策略具有十分重要的意义。

发明内容

发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于酪氨酸酶催化的细胞膜 和细胞壁的荧光标记方法，并进一步提供了所述方法的应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明公开了一种针对细胞膜和细胞壁的荧光标记 方法，包括两种方案：(1)使用酪氨酸酶和含苯酚基团的荧光分子；(2)使用酪氨酸酶、生物素基酪酰胺和荧光染料接枝的亲和素。

优选的，所述的酪氨酸酶为来源于菌菇的多酚氧化酶。

优选的，所述的含苯酚基团的荧光分子包括Cy3-酪酰胺、Cy5-酪酰胺、Cy7-酪酰胺、 AlexaFluor 488-酪酰胺、AlexaFluor 555-酪酰胺和AlexaFluor 568-酪酰胺。

优选的，所述的荧光染料接枝的亲和素包括异硫氰酸荧光素-亲和素和罗丹明-亲和 素。

进一步的，本发明还提供了该荧光标记方法中方案(1)的具体操作，包括以下步骤：

(1)清洗生物样本2～3次，将酪氨酸酶和带有苯酚基团的荧光分子加入到样本中，37℃或室温下孵育10～15分钟；

(2)孵育完成后，再清洗样本2次，除去酪氨酸酶和未接枝的荧光分子。

其中，步骤(1)中，酪氨酸酶和带有苯酚基团的荧光分子用于样本染色的浓度范围分别为10-500μg/mL和0.1-100μg/mL。