[发明专利]基于双DNA四面体结构检测FR的电化学生物传感器

说明书

本发明属于生物领域，具体涉及一种基于双DNA四面体结构检测FR的电化学生物传感器。所述生物传感器包括探针和修饰电极。所述探针包括带有叶酸的DNA四面体靶向探针和带有叶酸的DNA四面体信号放大探针。本发明构建了一种操作简单，灵敏度高的检测叶酸受体的生物传感器，该生物传感器基于DNA四面体设计，具有灵敏度高、特异性好、操作简单和无污染等优点。

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种基于双DNA四面体结构检测FR的电化学生物传感器。

背景技术

目前恶性肿瘤已成为人类死亡的主要原因之一。在恶性肿瘤的早期阶段，癌症是最常见的恶性肿瘤，没有明显的非特异性症状^[1,2]。尽管这些年来癌症研究取得了许多进展，但是目前我们依旧没有办法阻止癌症的发展。但是，癌症的早期诊断可以显着提高治愈率和存活率^[3,4]。常见的癌症筛查方法包括基因检测、影像学检查、内窥镜检查、病理检查等。但是这些方法都不适用于癌症的早期诊断，而甲胎蛋白(AFP)、microRNA^[5]等肿瘤标志物的发现与发展为癌症的早期诊断提供了新方向，并且肿瘤标记物检测是早期发现癌症的最有效和潜在方法，研究表明，肿瘤细胞表面通常会超表达多个受体，如叶酸受体^[6]、表皮生长因子受体^[7]、胰岛素受体^[8]等。其中叶酸受体是一种跨膜单链糖蛋白，在正常组织中极少存在，然而在多种肿瘤细胞表面，如卵巢癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌等，过度表达，通常比正常细胞高出20～200倍^[3]，因此叶酸受体具有良好的肿瘤组织特异性，是一种较为理想的肿瘤标志物。叶酸是一种水溶性维生素B，在细胞环境中的叶酸可以特异性的识别叶酸受体。利用叶酸受体在肿瘤细胞和正常细胞上表达的差异性及叶酸受体与叶酸和叶酸类似物结合的高特异性、高亲和性，可以将叶酸用于肿瘤细胞的特异性检测。

传统的叶酸受体(FR)的检测方法包括放射免疫测定法(RIA)^[9,10]和酶联免疫吸附测定法(ELISAs)^[11]。这两种方法主要依赖于FR与相应抗体之间的相互作用，虽然都可以达到较高的灵敏度，但是这两种方法都有自身不可忽视的缺点。其中放射免疫测定法过程耗时长、操作复杂且含有一些反射物质，可能对人体健康造成危害，而酶联免疫吸附测定法不仅耗时长，而且还有酶的活性以及成本等问题需要考虑。目前，叶酸受体的检测主要依靠传统的放射免疫测定法，它利用叶酸受体与相应抗体之间的相互作用，虽然可以达到高灵敏度，但是过程耗时长且含有一些反射物质，可能对人体健康造成危害。

此外一些依赖于FR和FA之间特定相互作用的新方法已经被提出，比如通过结合荧光、电化学、比色和化学发光等^[12]信号转导机制来提高检测的简便性和适应性。Zhan等^[13]人提出了一种基于叶酸受体与DNA上修饰的叶酸相结合，保护DNA不被核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ)剪切的电化学生物传感器。通过FR与FA的特异性结合，可以防止与FA终末结合的单链DNA被核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ)降解，这种反应称为终端保护。Wμ等^[14]人报道了一种透明双极微流控芯片电化学发光(ECL)系统，用于检测细胞膜上的叶酸受体(FR),获得了较高的灵敏度。Zhμ等^[15]人提出了一种以纳米金为基础的基于小分子与DNA相互作用，致使溶液中金纳米粒子的颜色变化的标准比色传感检测法。该方法可以在均匀条件下进行操作，使用方便，但由于比色法固有的缺陷，其灵敏度不够高。

发明内容

叶酸受体(FR)在人类多种肿瘤细胞表面过表达，而在正常细胞中表达受到限制，因此被认为是一种肿瘤生物标志物。此外，叶酸(FA)对叶酸受体具有很高的亲和力，被认为是一种典型的细胞靶向剂。本发明构建了一种操作简单，灵敏度高的检测叶酸受体的生物传感器，该生物传感器基于DNA四面体设计，具有灵敏度高、特异性好、操作简单和无污染等优点。

具体的，本发明的技术方案如下：