[发明专利]基于偏振结构光调制的多维层析荧光显微成像系统及方法

权利要求书

1.一种基于偏振结构光调制的多维层析荧光显微成像系统的显微成像方法，所述多维层析荧光显微成像系统包括：多个激光器、合束装置、声光可调谐滤波器、扩束装置、偏振分光器、半波片、空间光调制器、聚光透镜、空间滤光器、涡旋半波片、第一二向色镜、第一4f系统、第二二向色镜、物镜、发射滤光片、镜筒透镜、第二4f系统、光阑、波段分光装置和相机；其特征在于，所述显微成像方法包括以下步骤：

1)每一个激光器发出一个波段的线偏振激光，多个激光器分别发出不同波段的线偏振激光；

2)多束不同波段的线偏振激光经合束装置合束，同光轴传输至声光可调谐滤波器；通过声光可调谐滤波器快速选择通过的线偏振激光的波段；

3)选定波段的线偏振激光经扩束装置进行扩束，经偏振分光器和半波片至空间光调制器；

4)在空间光调制器上加载周期性的黑白相间的二值周期条纹，激光被反射后形成多级线偏振衍射光，空间光调制器平面垂直于水平光轴；

5)多级线偏振衍射光再经半波片和偏振分光器出射，线偏振激光先后两次经过偏振分光器和半波片，保证从偏振分光器出射的多级线偏振衍射光的偏振方向与入射的线偏振激光的偏振方向一致；

6)多级线偏振衍射光经聚光透镜聚焦后至空间滤光器；聚光透镜的焦平面位于空间光调制器的傅里叶面，空间滤光器位于聚光透镜的焦平面处；多级线偏振衍射光经空间滤光器后只有±1级线偏振衍射光通过；

7)±1级线偏振衍射光经过紧邻空间滤光器放置的涡旋半波片，将±1级线偏振衍射光的偏振方向调节为与空间光调制器上的二值周期条纹的方向一致；

8)±1级线偏振衍射光经第一二向色镜后通过第一4f系统，再经第二二向色镜，由物镜汇聚至位于物镜后焦面的样本上，第一4f系统将空间光调制器的傅里叶面延迟到物镜的后焦面，即通过第一4f系统使得物镜的后焦面位于空间光调制器的傅里叶面；

9)±1级线偏振衍射光在物镜的后焦面上干涉形成正弦条纹照明，激发样本产生荧光，荧光返回后由物镜收集，经第二二向色镜后，通过发射滤光片滤波，再由镜筒透镜聚焦；第一二向色镜与第二二向色镜完全相同，但空间放置方向互相垂直，从而消除单独使用第二二向色镜引入的偏振畸变；

10)在镜筒透镜与相机之间设置第二4f系统，从而将镜筒透镜的焦平面延迟到相机所在的平面；

11)在第二4f系统中间首先放置光阑，从而控制成像视场的大小；

12)在第二4f系统中间，光阑之后设置波段分光装置，波段分光装置将荧光按照波段从空间上分开，从而将不同波段荧光投射到相机不同的位置，荧光的每一个波段对应相机上的一个位置，作为一个光谱探测通道；

13)相机通过不同位置采集相应波段的荧光，得到一张原始图像；

14)保持二值周期条纹的角度不变，改变空间光调制器上加载的二值周期条纹的条纹相位，使得条纹相位相差π，重复步骤1)～13)，再得到一张原始图像，从而得到二值周期条纹在一个角度下的两张原始图像，构成一组原始图像；

15)二值周期条纹绕着水平的光轴旋转π/n，重复步骤1)～14)，每一个角度获得一组原始图像，n≥3，从而得到n组原始图像，每一个角度的二值周期条纹对应一个偏振调制；

16)得到n组原始图像后，对每一组原始图像按照不同的光谱探测通道进行层析图像重建得到n张层析图像，并将n张层析图像平均，从而得到每个光谱探测通道对应的宽场光学层析图像，进而得到光谱相关的信息；对这n个层析图像进行偏振解调则得到偏振相关的信息，包括以下步骤：

a)原始图像：

n组原始图像中，每一组原始图像对应相应的偏振调制方向为θ_i，i＝1,…,n，每组中包含两张正弦照明图案，这两张正弦照明图案的条纹方向与偏振调制方向一致，条纹相位相差π；

b)不同光谱探测通道对齐：

每一张原始图像都包含m个光谱探测通道，它们位于互不重叠的空间位置，先将不同的光谱探测通道截取分开，然后通过每个光谱探测通道乘以各自对应的仿射变换矩阵对不同光谱探测通道的图案进行空间对齐；

c)偏振调制的照明光强矫正：

对每一个光谱探测通道，得到2n张原始图像，分别为和其中下标Pi代表不同的偏振调制，i＝1,…,n，下标SIj代表不同相位的两张正弦照明图案，j＝1,2，当偏振调制方向即二值周期条纹的角度发生变化时，±1级线偏振衍射光的强度会发生波动，故需要对不同偏振调制下的照明光强进行矫正，每个偏振调制方向对应的图像除以各自的矫正矩阵即得到矫正后的图像I_SI1,Pi和I_SI2,Pi；

d)求取不同偏振调制下的光学层析图像：

对每一个偏振调制的两张正弦照明图案平均，则得到该偏振调制下均匀照明对应的图像I_u,Pi：

结合I_U,Pi和与矫正后的图像I_SI1,Pi或I_SI2,Pi，采用高低频融合重构算法，获得该偏振调制对应的光学层析图像I_OS,Pi；

e)求取宽场光学层析图像:

对不同偏振层析图案平均，获取宽场光学层析图像I_os，即:

f)对每个光谱探测通道，重复步骤b)～e)，从而求得所有光谱探测通道的宽场层析图像；

g)求取样本的偏振信息：

样本的偏振信息包括荧光偶极子偏振方向α和偏振调制度OUF，当偏振调制方向为θ_i时，荧光偶极子激发强度I_OS,Pi为：

I_OS,Pi＝I_DC+I_AC·cos(2θ_i-2α),

其中，I_DC为直流分量，I_AC为交流分量，θ_i为偏振调制方向，i＝1,…,n，α为荧光偶极子偏振方向，荧光分子和生物分子形成偶极子，表达成矩阵形式为：

其中，θ_i为偏振调制方向已知，通过矩阵求逆即求得α,I_DC,I_AC.偏振调制度OUF＝2I_AC/(I_AC+I_DC)，进而得到光谱相关信息。