[发明专利]一种酪氨酸磷酸酶底物鉴定方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种酪氨酸磷酸酶底物鉴定方法。本发明所提供的酪氨酸磷酸酶底物鉴定方法，包括：将包括潜在的与酪氨酸磷酸酶相互作用的底物的体系置于酪氨酸磷酸酶‑PafA融合蛋白、pup蛋白存在的条件下，并标记pup蛋白；通过被标记的pup蛋白，富集潜在的与酪氨酸磷酸酶相互作用的底物；所述酪氨酸磷酸酶‑PafA融合蛋白包括酪氨酸磷酸酶片段和PafA片段，所述酪氨酸磷酸酶片段具有底物捕获突变体。本发明所提供的酪氨酸磷酸酶底物鉴定方法和体系可以将针对酪氨酸磷酸酶的生物学研究推广到任意一个重要的酪氨酸磷酸酶家族成员，具有良好的产业化前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种酪氨酸磷酸酶底物鉴定方法。

背景技术

生物体内的信号转导需要非常复杂且精准的平衡，需要各种蛋白适配器、蛋白效应器、蛋白酶与底物以及其它蛋白复合体的参与，从而将细胞外的信号适时且准确的传递到细胞内的靶点。控制这种平衡的调节方式有很多，其中激酶和磷酸酶调控的信号转导过程中的重要蛋白的磷酸化和去磷酸化就可以调控这种平衡。因此研究激酶和磷酸酶在生物体内的动态的平衡调节对于研究细胞的信号转导具有非常重要的意义。

蛋白质与蛋白质之间的相互作用一直是生物化学和细胞生物学研究的前沿热点问题。随着研究的深入，细胞内大部分蛋白质之间的相互作用具有瞬时性的特性已经越来越被认可，其中就包括酪氨酸磷酸酶和催化底物之间的作用模式。传统的蛋白互作检测方法，包括免疫共沉淀联合质谱法、荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance EnergyTransfer,FRET)以及酵母双杂交技术已经不能满足实时检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用的需求。基于连接酶介导的邻近标记是近几年被报导的一种可以在活细胞条件下将蛋白质与蛋白质之间的相互作用(包括微弱相互作用和瞬间相互作用)转化为稳定共价连接的一种新型技术，它的问世无疑为检测蛋白互作提供强有力的技术保证。目前应用较广的邻近标记技术包括BioID、APEX等，然而这两种方法仍然具有局限性：BioID背景过高，APEX需要加入对细胞有损伤的过氧化氢。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种酪氨酸磷酸酶底物鉴定方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种酪氨酸磷酸酶底物鉴定方法，包括：

1)将包括潜在的与酪氨酸磷酸酶相互作用的底物的体系置于酪氨酸磷酸酶-PafA融合蛋白、pup蛋白存在的条件下，并标记pup蛋白；

2)通过被标记的pup蛋白，富集潜在的与酪氨酸磷酸酶相互作用的底物；

所述酪氨酸磷酸酶-PafA融合蛋白包括酪氨酸磷酸酶片段和PafA片段，所述酪氨酸磷酸酶片段具有底物捕获突变体。

在本发明一些实施方式中，所述酪氨酸磷酸酶片段选自SHP1片段、SHP2片段、PTP1B片段、TCPTP片段、PTPRK片段以或CD45片段。

在本发明一些实施方式中，所述步骤1)中，包括潜在的与酪氨酸磷酸酶相互作用的底物的体系为目标细胞，所述步骤1)具体为：在酪氨酸磷酸酶-PafA融合蛋白、pup蛋白存在的条件下培养目标细胞，并标记pup蛋白。

在本发明一些实施方式中，所述步骤1)还包括；将培养所获得的细胞裂解，以提供裂解液。

在本发明一些实施方式中，所述酪氨酸磷酸酶-PafA融合蛋白和/或pup蛋白由目标细胞表达。

在本发明一些实施方式中，所述pup蛋白包括pup片段和标签蛋白片段，所述标签蛋白选自生物素标签蛋白。

在本发明一些实施方式中，所述步骤1)中，通过生物素标记pup蛋白。

在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中，基于生物素-亲和素系统，通过被标记的pup蛋白，富集潜在的与目标蛋白相互作用的底物。