[发明专利]抑制Mettl3基因表达的shRNA及其重组腺相关病毒与应用

说明书

本发明涉及一种抑制Mettl3基因表达的shRNA及其重组腺相关病毒与应用。本发明抑制Mettl3基因表达的shRNA的序列为：5’‑GCAGAGCAAGAAGGTCAGTCA‑3’。本发明通过将抑制Mettl3基因表达的shRNA构建于腺相关病毒表达载体上，再将重组表达载体与腺相关包装质粒、辅助质粒pHelper一起转染包装细胞，获得重组腺相关病毒AAV9‑shMettl3。本发明的组腺相关病毒AAV9‑shMettl3在体内及体外特异性抑制小鼠心肌细胞中Mettl3基因的表达。同时，本发明对于深入研究小鼠Mettl3基因的功能及其相关疾病的治疗均具有重要的科学意义及应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，特别涉及一种抑制Mettl3基因表达的shRNA及其重组腺相关病毒与应用。

背景技术

RNA分子的化学修饰类型已经报道了150多种。然而，直到最近几年，学界才逐渐认识到RNA分子中腺嘌呤的第6位N原子发生甲基化修饰(N⁶-methyladenosine,m⁶A)是真核生物信使RNA(mRNA)上含量最多的化学修饰之一。m⁶A修饰广泛存在于大部分真核生物的mRNA中，如酵母、果蝇、植物及哺乳动物中，甚至在某些病毒的RNA中也发现存在m⁶A修饰，提示其广泛及重要的生物学功能。而Methyltransferase like 3(Mettl3)是第一个被鉴定为具有催化RNA分子中m⁶A修饰生成的甲基转移酶。Mettl3已被证明在众多生物学过程中都发挥着非常重要的生理学作用，比如参与生物钟的延长或缩短，维持干细胞多能性或分化，促进肿瘤的发生和发展进程以及对影响神经修复及病毒感染等。因此，对于Mettl3基因的功能研究已经逐渐成为生命科学领域的研究热点。

随着RNA干扰技术的不断深入发展，将小干扰RNA(siRNA)设计合成为shRNA，并构建到腺相关病毒(AAV)表达系统，进而在动物体内感染特定的靶细胞，特异性沉默相关基因表达，已经成为研究基因功能的最有效的手段之一，也是靶向基因治疗的有效途径。与传统慢病毒和腺病毒等相比，腺相关病毒具有感染效率高、免疫原性低、长时间稳定表达及无致癌隐患等优点，非常适合于活体动物的体内研究。而且，AAV-shRNA腺相关病毒表达系统有效克服了以往人工合成的siRNA转染效率低、持续时间短、体内干扰效率差、无靶向功能等不足，已经逐步发展成为在体内研究基因功能的有效途径之一。

针对小鼠Mettl3基因设计特异性的shRNA序列，构建相应的AAV腺相关病毒表达载体，可为今后深入研究小鼠Mettl3基因的功能奠定基础，可广泛应用于Mettl3基因相关的体内研究及靶向干预，具有重要的应用前景和经济价值。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抑制Mettl3基因表达的shRNA。

本发明的另一目的在于提供携带上述shRNA的重组腺相关病毒。

本发明的再一目的在于提供上述shRNA及其重组腺相关病毒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抑制Mettl3基因表达的shRNA，其靶向Mettl3基因的序列为：5’-GCAGAGCAAGAAGGTCAGTCA-3’。

所述的shRNA特异性抑制小鼠心肌细胞中Mettl3基因的表达。

所述的心肌细胞为分裂及非分裂状态的心肌细胞。

所述的shRNA序列位于小鼠Mettl3基因mRNA(NM_019721.2)的848位点开始的21个碱基序列。