[发明专利]抑制Mettl3基因表达的shRNA及其重组腺相关病毒与应用

权利要求书

1.一种抑制Mettl3基因表达的shRNA，其特征在于：所述的shRNA靶向Mettl3基因的序列为：5’-GCAGAGCAAGAAGGTCAGTCA-3’。

2.根据权利要求1所述的抑制Mettl3基因表达的shRNA，其特征在于：所述的shRNA的DNA序列为：

正义链：

5’-GATCCGCAGAGCAAGAAGGTCAGTCAttcaagagaTGACTGACCTTCTTGCTCTGCTTTTTTG-3’；

反义链：

3’-GCGTCTCGTTCTTCCAGTCAGTaagttctctACTGACTGGAAGAACGAGACGAAAAAACTTAA-5’。

3.根据权利要求1所述的抑制Mettl3基因表达的shRNA，其特征在于：

所述的shRNA抑制小鼠Mettl3心肌细胞中基因的表达；

所述的心肌细胞为分裂及非分裂状态的心肌细胞。

4.权利要求1或2所述的抑制Mettl3基因表达的shRNA在抑制小鼠心肌细胞中Mettl3基因表达中的应用。

5.一种靶向抑制小鼠Mettl3基因的重组腺相关病毒，其特征在于：通过将权利要求1所述的shRNA采用腺相关病毒无辅助病毒系统AAV Helper-Free System制备得到。

6.根据权利要求5所述的靶向抑制小鼠Mettl3基因的重组腺相关病毒，其特征在于：重组腺相关病毒制备的方法为：将shRNA构建于腺相关病毒AAV表达载体上，再将重组表达载体与腺相关包装质粒、辅助质粒pHelper一起转染包装细胞，获得重组腺相关病毒AAV9-shMettl3。

7.一种靶向抑制Mettl3基因的重组腺相关病毒的构建方法，包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的抑制小鼠Mettl3基因表达的shRNA序列合成正义链和反义链，退火，得到shRNA模版；

(2)将腺相关病毒表达载体pAAV-H1-CAG-EGFP用BamHI和EcoRI双酶切，回收线性化pAAV-H1-CAG-EGFP；

(3)将线性化的pAAV-H1-CAG-EGFP和步骤(1)得到的shRNA模板连接，转化大肠杆菌，鉴定，提取质粒，得到重组质粒pAAV-H1-Mettl3-shRNA-CAG-EGFP；

(4)将步骤(3)的重组质粒pAAV-H1-Mettl3-shRNA-CAG-EGFP、腺相关包装质粒pAAV-RC9及辅助质粒pHelper共同转染AAV-293细胞，培养，获得重组腺相关病毒AAV9-shMettl3。

8.根据权利要求7所述的靶向抑制Mettl3基因的重组腺相关病毒的构建方法，其特征在于：

步骤(1)所述的正义链5’端添加了GATCC，与BamHI酶切后形成粘端互补；正义链3’端添加TTTTTT转录终止信号；

步骤(1)所述的反义链模板的5’端添加AATTC，与EcoRI酶切后形成粘端互补；

步骤(3)中所述的连接为采用T4 DNA连接酶连接。

9.根据权利要求7所述的靶向抑制Mettl3基因的重组腺相关病毒的构建方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的退火的反应体系为：1μL 100μM的正义链、1μL 100μM的反义链、0.5μLT4 Polynucleotide Kinase、1μL 10×T4 ligation buffer、6.5μL RNase-free water；

步骤(1)中所述的退火的反应程序为：37℃，30min；95℃，5min；-5℃/min逐步降温至25℃。