[发明专利]一种海蛇毒特异性检测方法和试剂盒

说明书

本发明公开了微量海蛇毒特异性检测方法和试剂盒，属于生物技术领域。本发明通过提取毒素中微量基因，分别使用不同引物对作为特异性引物，经PCR扩增获得产物，通过琼脂糖凝胶电泳和测序后验证为海蛇特异性基因序列。本发明的检测方法和试剂盒具有特异性高，稳定性好，检测迅速，易于操作等优点，有利于规模化和自动化检测分析，是快速、特异的鉴别海蛇及其毒素的一种方法。

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及国内常见毒蛇中海蛇毒的检测方法和检测试剂盒；尤其涉及一种海蛇毒特异性检测方法和检测试剂盒。

背景技术

据《中国蛇类图谱》记载，我国沿海栖居着9属16种海蛇，是主要的海洋有毒生物。海蛇和眼镜蛇有密切的亲缘关系，均为剧毒蛇。海蛇的毒液属于最强的动物毒。海蛇广泛分布于南海、北部湾、海南、台湾、广西、广东和东海沿海的暖水海域。我国东南沿海地区是我国海洋产业开发的重点地区，近年来随着对海洋资源开发利用的不断增多，海上作业人员及海边度假游客遭受海洋生物伤的情况也时有发生。同时东南沿海海域具有极其重要的军事战略意义，所有海上军事行动比如海上军事演习、渡海登陆作战以及和平时期的岛屿防御等都要面临海洋生物伤的危险。文献资料与调研结果表明，海蛇咬伤是最严重的海洋生物伤,近年来其发病率呈不断上升的趋势。

我国东南沿海地区每年被海蛇咬伤或咬死的人数也不少, 广西每年均有被海蛇咬伤致死的病例记录，这种咬伤病例往往是海蛇排毒量大，患者中毒较明显。根据世卫组织被忽视的热带病问题战略技术咨询小组第十次会议的建议，世卫组织已把毒蛇咬伤列为需要高度重视的被忽视热带病。

我国海域分布的海蛇包括长吻海蛇，平颏海蛇，青环海蛇等。海蛇毒对小鼠的半数致死剂量LD50在0.044-0.24mg/kg之间。相同干重的海蛇毒致死毒性远高于眼镜蛇。

注射抗毒血清是目前世界范围内公认的对毒蛇咬伤最有效的急救措施，国外已有少数国家研制成抗海蛇毒血清产品，有的己应用于临床救治工作，海蛇咬伤目前国内尚无特效药物，患者往往都被送入当地的小医院，各级医疗单位依各自经验进行对症治疗，没有形成规范化的急救方案，效果欠佳。但是由于毒蛇种类繁多，非专业人士通常难以鉴别。毒蛇咬伤患者的治疗需要正确鉴别肇事毒蛇种类，方能正确选择适当的抗蛇毒血清，提高毒素拮抗效率获得理想的疗效，同时减少注射不匹配的抗蛇毒血清的几率，从而降低血清病等严重过敏反应发生的风险，错失治疗时机。然而目前我国蛇伤临床诊断主要依靠病人口述病史和临床表现，可能造成治疗的盲目性，由于缺乏快速、特异的实验室鉴别蛇毒种类的方法，难以针对性的进行治疗。此前海蛇的全基因组序列尚未公布，未见从样品尤其蛇毒中提取DNA 并扩增出靶标序列的特异性引物和方法。因此，本发明基于现代分子生物学技术，利用已有的研究基础，开发一种操作简单，鉴别准确，迅速高效，灵敏度高，特异性好的检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一种海蛇毒特异性检测方法，该方法利用PCR技术使用特异性的引物扩增目的基因来鉴别海蛇及海蛇毒，本方法可以检测出来自样品的微量DNA，具有检测灵敏度高，方法快速，易操作的优点。

本发明要解决的技术问题之二在于提供一种快速检测海蛇及其毒素的特异性引物对。

本发明要解决的技术问题之三在于提供上述特异性引物对或其互补序列在制备鉴别海蛇毒的产品中的应用。

本发明要解决的技术问题之四在于提供检测海蛇毒的PCR检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

在本发明的第一方面，提供一种海蛇毒特异性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，设计PCR引物序列和组合如下；

第二步，提取微量海蛇毒基因DNA；

第三步，采用第一步设计的任意一对引物对和第二步提取的DNA模板，进行PCR扩增反应。