[发明专利]一种高温好氧条件下产木糖醇的耐热酵母工程菌株的构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种高温好氧条件下产木糖醇的耐热酵母工程菌株及其构建方法和应用，其中耐热酵母工程菌株为耐热酵母工程菌株YZB194，其分类命名为：马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2019年11月25日，保藏编号：CGMCC NO.19004。YZB194在42℃好氧条件下，利用发酵罐分批补料发酵共利用121g/L葡萄糖和205g/L木糖合成203g/L木糖醇，木糖醇合成速率为2.99g/L/h，木糖转化率达到最大理论值的99％。

技术领域

本发明属于微生物代谢工程以及微生物发酵工程领域，具体涉及一种高温好氧条件下产木糖醇的耐热酵母工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术

木糖醇是一种五碳多元醇，是木糖代谢的正常中间产物[11]。它被人体利用时不需要胰岛素的促进作用，在体内可促进胰岛素的少量分泌；用于静脉滴注时，血液中的丙酮酸、乳酸以及葡萄糖的含量会有所下降，肝糖元则有增加；无细胞毒性，可透过细胞膜成为组织的营养等。这些特性使得木糖醇具有重要的应用价值。另外，木糖醇作为甜味剂，口感清凉，而且可以预防龋齿；作为食品添加剂，可延长食品的保鲜期；木糖醇是糖尿病患者的理想的辅助治疗剂和营养甜味剂[1,5,6,8,9,11]。

目前木糖醇的生产主要是通过工业生产的方式。工业生产主要是化学加氢法，加氢需要高温高压，增加了生产成本，同时工艺复杂、收率低，限制了木糖醇的大规模生产，并且加氢需要镍的催化作用，这就带来了低食品安全和环境污染的隐患[3]。针对化学法生产木糖醇存在的问题，国际上从20世纪70年代开始研究用微生物法来生产木糖醇。微生物法的原理是利用细胞内的木糖还原酶(XR)，将木糖还原为木糖醇，而不需要镍的催化作用，保证的食品安全却又不会带来环境污染；氢来自细胞内的还原性辅酶和氢离子，不需另行制氢，反应在常温常压下进行，降低了成本。又由于酶的底物专一性，使得原料不必高度精制。因此，利用微生物来生产木糖醇将具有污染少、成本低、产品质量高并且无环境污染等优点，具有非常大的发展前景。

本发明中用来生产木糖醇的菌株为马克斯克鲁维耐热酵母(K.marxianus)。马克斯克鲁维酵母在高温下发酵有以下几个优点：1、高温下发酵可以降低发酵中的冷却费用；2、纤维素酶等的最适催化温度较高，高温会提高以淀粉、纤维素等生物质为原料的同步糖化发酵(SSF) 效率，促进糖化，减少在酶上的费用[4]；3、能在耐热范围内生存的微生物较少，因此，高温会降低污染的风险[8,12]。除此之外，马克斯克鲁维酵母是一种GRAS(general regarding as safe)酵母，广泛的在乳制品、葡萄酒发酵制造中存在，对环境、动物及人类是安全的微生物。它能够在较高的温度下生长，最高达52℃，具有很高的生长速率(0.86-0.99h^-1，40℃)[2]。马克斯克鲁维酵母有很高的代谢多样性，能利用多种工业上的底物糖类生长发酵。能利用多种廉价底物、耐热、高生长率等特点，使其被认为是替代酿酒酵母用来进行工业发酵和外源蛋白表达的候选者。由于马克斯克鲁维酵母有很多比酿酒酵母优秀的品质，而被越来越多的用于生物能源的生产[4]，所以利用马克斯克鲁维酵母发展成木糖醇生产菌株有非常重要的应用价值。

木糖是半纤维素生物质水解的主要产物，是世界上第二富集的发酵原料[17]。作为木质半纤维素水解产物中含量最多的五碳糖，木糖无疑是从可再生生物质中生产高附加值产品的关键[10]。木质纤维素生物质(如农业废物玉米秸秆等)是丰富的可再生材料，同时木质纤维素可以从农业废物如玉米秸秆等中获得，不会与粮食造成竞争。因此，利用生物从可再生资源中生产有价值的产物木糖醇具有极大的经济和环境意义。葡萄糖和木糖是其水解液的主要两个单糖成份，要建立经济的工业利用过程，需要对两种糖的高效利用和发酵[6]，但目前的方法都不够高效，尤其是葡萄糖和木糖同时存在时，由于葡萄糖抑制效应，微生物利用木糖的能力常常被葡萄糖抑制而导致效率低下。各种工程菌株的构建，使利用木糖发酵生产木糖醇的能力不断提高，但是葡萄糖的抑制效应常常难以解除。在构建的马克斯克鲁维酵母菌株葡萄糖的抑制效应非常明显，因此利用葡萄糖和木糖共同发酵一直是一个瓶颈。