[发明专利]一种保健酒抗疲劳成分筛选方法

权利要求书

1.一种保健酒抗疲劳成分筛选方法，其特征在于，包括：保健酒成分定性分析、保健酒成分定量分析、斑马鱼模型药效评价、抗疲劳主效成分群筛选。

2.根据权利要求1所述保健酒抗疲劳成分筛选方法，其特征在于，所述保健酒成分定性分析包括：

采用HPLC-QTOF-MS/MS技术，对保健酒所含化学成分进行鉴定：

色谱条件：柱温25℃；流动相：水(含一定浓度甲酸)(A)-乙腈(含一定浓度甲酸)(B)；流速：0.8mL/min；进样体积：2μL；梯度洗脱条件为：0-2.5min，10％B；2.5-20min，10-20％B；20-35min，20-35％B；35-40min，35-60％B；40-45min，60-90％B；45-50min，90-95％B；50-60min，95％B；

质谱条件：干燥氮气流速：10L/min；干燥氮气温度：350℃；雾化压力：35psig；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11.0L/min；毛细管电压：4000V；锥孔电压：65V；OCT 1RF Vpp：750V；裂解电压：135V；二级碰撞能量：15V、25V、35V、50V；正、负离子模式下全扫描模式监测，离子质量数扫描范围设置为m/z 50–1700；

采用GC-MS技术，对保健酒中来自当归、砂仁、仙茅、益智、肉桂、丁香的挥发性成分进行鉴定：

色谱条件：仪器：Agilent 7890B GC-5977A MSD；色谱柱：Agilent19091S-433UI:HP-5ms Ultra Inert(30m×250μm,0.25μm)；0℃-325℃；载气：99.999％高纯He；流速：1mL/min；进样体积：1μL；分流比：10︰1；升温程序如下：初始温度40℃，维持5min，以8℃/min升温至250℃。

质谱检测条件：全扫描模式监测，离子质量数扫描范围设置为m/z 50–500，扫描速度1562[N＝2]，扫描频率2.9/s。

3.根据权利要求1所述保健酒抗疲劳成分筛选方法，其特征在于，所述保健酒成分定量分析包括：

建立HPLC-QQQ-MS定量分析方法，测定保健酒中来自于淫羊藿、葛根、肉苁蓉、黄芪、丹参、枸杞子、怀牛膝、当归药材中特征性成分的含量；

色谱条件：柱温25℃；流动相：水(含一定浓度甲酸)(A相)-乙腈(含一定浓度甲酸)(B相)；流速：0.3mL/min；进样体积：5μL；梯度洗脱条件如下：0-3.5min，25-40％B；3.5-4min，40-75％B；4-15min，75％B；

质谱条件：干燥气温度：350℃；干燥气流速：9L/min；载气压力：30psi；毛细管电压：4000V(正)，3500V(负)；正负离子模式下多重反应监测模式检测；

建立GC-MS定量分析方法，测定保健酒中乙酸龙脑酯、丁香酚的含量：

色谱条件：仪器：Agilent 7890B GC-5977A MSD；色谱柱：Agilent19091S-433UI:HP-5ms Ultra Inert(30m×250μm,0.25μm)；0℃-325℃；载气：99.999％高纯He；流速：1mL/min；进样体积：1μL；分流比：10︰1；升温程序如下：初始温度40℃，维持5min，以8℃/min升温至250℃；

质谱条件：离子源温度：320℃，四级杆温度：150℃，单离子检测扫描(single ionmonitoring，SIM)模式下进行扫描，分别采用各检测物质丰度最高碎片离子作为定量依据，分别为内标(水杨酸甲酯)：m/z 120.1；乙酸龙脑酯：m/z 95.2；丁香酚：m/z 164.1；溶剂延迟：3分钟。

4.根据权利要求1所述保健酒抗疲劳成分筛选方法，其特征在于，所述斑马鱼模型药效评价包括:

在六孔板中进行，设置正常对照组和模型组，每个实验组均处理60尾4dpf AB系斑马鱼，用亚硫酸钠诱导疲劳模型；不同给药剂量的保健酒，处理3天后检测斑马鱼的乳酸和ATP含量。

5.根据权利要求1所述保健酒抗疲劳成分筛选方法，其特征在于，所述抗疲劳主效成分群筛选包括：

采用偏最小二乘回归分析法，通过拟合药效指标与各化合物含量之间的数理方程，以具体的数学表达式综合反映各成分对药效的重要性；将保健酒各批次所测定化合物的含量数据与抗炎2个药效指标(乳酸和ATP)数据输入Simca-P13.0软件中进行分析，化合物的含量数据为自变量X(X1，X2，X3，X4，,X5，,X6，X7，X8，X9，X10)，乳酸作为因变量Y1，ATP为因变量Y2，经过PLS-DA分析后，获得保健酒的2个药效指标与化合物含量之间的回归方程，并绘制回归系数图；数理统计研究表明，当满足条件时，回归方程中得到的回归系数用来预测模型与药效指标的相关性。