[发明专利]抑制黄曲条跳甲精氨酸激酶蛋白表达的shRNA及制备方法、引物与应用

说明书

本发明公开抑制黄曲条跳甲精氨酸激酶蛋白表达的shRNA及制备方法、引物与应用。其中抑制黄曲条跳甲精氨酸激酶蛋白表达的干扰性shRNA，依次包括靶序列、环形结构序列、靶序列的互补序列；其中所述靶序列为GGAGUUCGAUGCCGUUAAGGA。本发明提供的抑制黄曲条跳甲精氨酸激酶蛋白表达的干扰性shRNA能稳定、高效、显著和特异性抑制薇甘菊中编码光捕获蛋白基因的mRNA表达。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及特异性靶向抑制黄曲条跳甲精氨酸激酶蛋白表达的干扰性shRNA及制备方法、引物与应用。

背景技术

黄曲条跳甲在全球范围内广泛存在，并且是广东地区的头号蔬菜害虫。目前对黄曲条跳甲还没有有效的防治方法，喷化学杀虫剂仍然是生产上主要的防治手段，但是化学农药的长期大量使用，不仅造成生态环境污染、影响食品安全，还导致害虫抗药性逐渐增强。因此，研制绿色防控技术非常迫切。

RNA干扰(RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。在抗虫研究中，喷在昆虫取食的农作物上的双链RNA(dsRNA)或短发卡结构RNA(shRNA)，随昆虫摄食进入中肠，被中肠细胞吞食，在Dicer作用下加工成siRNA而启动RNAi信号通路，引发重要基因沉默。如果目标mRNA在昆虫体内编码的是一个基本功能性蛋白，其表达受阻将导致昆虫死亡。RNAi抗虫技术有特异性强、效率高、操作简便、不易产生抗性及对环境友好等优点。RNAi具有很强的特异性，它只降解同源序列的mRNA，对其他序列的表达没有影响。因此可以针对特定害虫设计非常专一性的dsRNA或shRNA而不会影响其他有益昆虫，也不会危害其他动植物和人类健康。鉴于上述的众多优点，RNAi技术已成为研究基因功能及新型杀虫技术的新工具。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供特异性靶向抑制黄曲条跳甲精氨酸激酶蛋白表达的干扰性shRNA及制备方法、引物与应用。

本发明的技术方案如下：

抑制黄曲条跳甲精氨酸激酶蛋白表达的干扰性shRNA，其中，所述干扰性shRNA依次包括靶序列、环形结构序列、靶序列的互补序列；

其中所述靶序列为GGAGUUCGAUGCCGUUAAGGA。

进一步地，所述干扰性shRNA的序列结构如下所示：

一种本发明所述的抑制黄曲条跳甲精氨酸激酶蛋白表达的干扰性shRNA的制备方法，其中，包括步骤：

根据靶基因的序列，设计出干扰性shRNA序列；

根据干扰性shRNA序列，设计一对引物序列；

利用所设计的一对引物，通过填充反应生成制备shRNA转录模板；

利用制备好的shRNA转录模板，通过体外转录的方式，制备得到干扰性shRNA。

一种用于制备本发明所述的抑制黄曲条跳甲精氨酸激酶蛋白表达的干扰性shRNA的引物，其中，所述引物序列为：

上游引物序列P1：

5’TAATACGACTCACTATAGGAGTTCGATGCCGTTAAGGACTTGCTTC3’；(含T7启动子序列TAATACGACTCACTATA、靶标序列GGAGTTCGATGCCGTTAAGGA、环形结构序列CTTGCTTC)

下游引物序列P2：

5’AAGGAGTTCGATGCCGTTAAGGA GAAGCAAG3’。(含人为添加的2个A、靶标序列GGAGTTCGATGCCGTTAAGGA、环形结构序列的互补序列GAAGCAAG)