[发明专利]一种高粱中单宁浓度的检测方法

说明书

本申请公开了一种高粱中单宁浓度的检测方法，包括：提取高粱样品中的单宁组分作为单宁样品；对单宁样品及单宁标准溶液进行液相色谱–质谱联用分析，其中液相色谱为亲水作用液相色谱，液相色谱的检测器为荧光检测器，质谱为飞行时间质谱；以及根据对单宁标准溶液进行液相色谱–质谱联用分析所得的结果得到标准曲线，计算单宁样品的单宁浓度。本申请的检测方法能有效分离酿酒用高粱单宁不同聚合度的聚合体，选择性和特异性好，鉴定了酿酒用高粱单宁各聚合度的组成。其方法精度高，分离样品高粱单宁至11聚体，标准曲线R²可达0.9978，线性良好，相较比色法定量准确度高；流动相能够使用常用的反相体系，便于开展酿酒用高粱中单宁的全面有效分析。

技术领域

本申请涉及化学检测领域，更具体涉及一种高粱中单宁浓度的检测方法。

背景技术

单宁是很多植物中都存在的次生代谢产物，通常用作抵御病原体和捕食者的酚类物质存在。单宁根据其化学结构特征可被分为水解单宁及缩合单宁。水解单宁(或称可水解单宁)是棓酸，或与棓酸有生源关系的酚羧酸与多元醇组成的酯。而缩合单宁(原花色素)是羟基黄烷类单体组成的缩合物，单体间通常以C-C键连接，在水溶液中不易分解，在热的醇-酸溶液中能酸解生成花色素。研究表明高粱中的单宁几乎均为缩合单宁，也即原花色素。单宁的存在不仅能够影响高粱的口感与消化特性，也同时影响了高粱的生物利用度。

研究表明单宁在白酒的酿造过程中，对发酵以及白酒的风格、品味与特性的形成具有重要的影响。单宁与产酒率呈负相关，过多的单宁会阻碍酒精发酵，但同时，单宁的存在会增加白酒的风味，白酒中的芳香族化合物可经微生物发酵从原料中的单宁转化而来，适量的单宁还可抑制发酵中的有害微生物。

目前利用高效液相色谱技术对原花色素进行分离并分析是解析原花色素组成的最常用手段，主要方法包括：

一、反相高效液相色谱(RP-HPLC)

在反相高效液相色谱技术中，流动相比固定相更具极性，因此化合物以极性逐渐降低的顺序洗脱下来。RP-HPLC技术能用于分离低聚原花色素，但是很难分离聚合度高的原花色素，因为伴随聚合度的增加，原花色素的结构和立体异构体的可能组合也会变得更多，导致原花色素在色谱图上以单一的宽峰形式呈现。因此反相高效液相色谱常与酸降解相结合，用来识别原花色素的组成结构单元，即原花色素的末端单元与延伸单元。原花色素的延伸单元在亲核试剂的攻击下，C-4位与亲核试剂结合形成加成产物，而其末端单元形成相应的黄烷醇单体。间苯三酚和苄硫醇法是最常用于酸降解的亲核试剂，苄硫醇法能够用于识别A、B型连接键，但因其臭味而使用有限。

二、正相高效液相色谱(NP-HPLC)

正相-高效液相色谱技术使用二氧化硅作为极性固定相，而有机溶剂作为低极性流动相，其洗脱顺序与RP-HPLC相反，通常以聚合度的增加顺序洗脱原花色素。在1993年，NP-HPLC首次被用于从可可豆和葡萄籽中分离原花青素至四聚体。后来，此法经改进后能够进一步分离原花色素至十聚体，并成功地应用于水果、蔬菜、谷物、坚果、饮料和香料等39种不同食物中原花色素的测定。

三、亲水作用液相色谱(HILIC)

HILIC方法最早在1990年提出用于多肽和核酸的分析。它属于NP-HPLC的一种变形，分析物通过在亲水固定相上的水层和疏水洗脱液之间分配而保留，因此其洗脱顺序与NP-HPLC的一致，但是其流动相使用的是与RP-HPLC相似的半水溶性流动相，因此克服了原花色素这类强极性物质在NP-HPLC流动相中难保留的缺点，使待分析物和样品基质在流动相中的溶解度得以提高。典型的HILIC流动相构成是水或者挥发性缓冲盐溶液以及40–97％的乙腈，使得样品在质谱中的电离更具传导性。

目前分析高粱中的原花青素组成以正相为主，其流动相不利于环保；另外，对于酿酒用高粱中单宁的检测仅限于总量的比色测定，比色法误差较大。

发明内容