[发明专利]一种原位杂交探针

说明书

本发明提供一种原位杂交探针，包括探针序列和信号基团序列。本发明的探针序列的设计，用茎环序列连接接头序列和检测序列，既增加探针的稳定性，也为两次配对识别提供了先决条件；应用探针和目标、探针和信号序列的两次配对识别，提高实验检测准确性，减少背景信号，降低假阳性的概率；信号序列的引入，使后续检测更加灵活，降低实验成本。同时后续可扩展性能更加优良。

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种原位杂交探针。

背景技术

现有技术中的常规原位杂交探针的设计是根据碱基互补配对的原则，针对目标基因序列设计合成单一的线性寡核苷酸探针，其长度范围多为30-200bp。寡核苷酸探针的末端进行荧光基团的标记或其他检测基团标记，溶于杂交缓冲液后直接用于原位杂交的检测，探针通过碱基互补配对识别目的基因序列并结合，或使用检测二抗进行检测。其后通过普通或荧光显微镜观测荧光信号杂交信号。此检测过程，基本为“探针——目的序列”的单次识别配对，此配对的准确性，决定了此实验检测过程的特异性或准确性。

由于实验过程中探针与目的序列的单次识别配对，探针的非特异结合或引起假阳性，或者导致背景信号高；同时，检测基团直接与探针相连，缺少灵活性和升级空间，因此缺少特异性高，增幅效果好的信号放大系统。对于含量低的目标分子，较难得到优质的特异阳性信号；容易受不同样本的组织结构，物理环境的不同所影响，产生高背景或假阳性。因此，单条线性探针的稳定性有所欠缺。

发明内容

针对上述缺陷，本发明引入双探针系统，增加对目标序列的识别能力与特异性。引入了“探针-目的序列”和“探针-信号序列”的两次识别配对，以及双探针之间的配合识别，大大降低非特异结合或样本结构引起的假阳性或高背景信号；信号序列的加入，也可以扩展出一个高效的信号级联放大系统，使特异信号得到有效的放大，应对低表达量目的分子的检测。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种原位杂交探针，包括探针序列和信号序列。

进一步地，所述探针序列包括5’端接头序列、中部连接序列和3’端目的基因检测序列。本发明的5’端接头序列是根据一种线虫基因组设计的匹配序列，与人、大鼠、小鼠的基因序列没有同源性，无特异结合，可用于结合后续的级联放大系统。

进一步地，所述中部连接序列具有茎环结构。本发明的探针序列的中部连接序列在常温或非杂交缓冲液环境下形成茎环结构，可提高探针的稳定性，增加探针的特异性；同时提供合适的空间构象，连接5’端序列和3’检测序列。

进一步地，所述3’端目的基因检测序列不形成发夹结构，并且根据所要检测的目的基因设计碱基序列。本发明探针序列的3’端检测序列按碱基互补配对的原则，根据需要检测的目的序列进行设计，通常针对目的序列的3’端特异保守区，30-50bp长度，GC％为40％-60％，此段区域避免形成发夹结构。

根据上述对本发明的探针序列的描述，所述探针序列的具体序列如下：TCACAACCTCCTAGAAAGAGTAGAcaagCTCAACTGGATTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGA AGAACATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN，其中TCACAACCTCCTAGAAAGAGTAGA(SEQ ID NO:1)是探针序列的5’端接头序列，caagCTCAACTGGATTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAAGAACAT(SEQ ID NO:2)是探针序列的中部连接序列(茎环)，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN是探针序列的3’端检测序列，其根据需要检测的目的序列进行设计，本发明完整的探针包含此三个区域，其形成的二级结构见图1。

进一步地，所述信号序列包括两个可与所述探针序列的5’端接头序列特异结合的序列，以及连接两个所述标记序列的中部延长序列