[发明专利]一种羧基微球偶联氨基的方法、致敏胶乳及试剂盒

说明书

本发明提供一种羧基微球偶联氨基的方法、致敏胶乳及试剂盒，属于医药试剂技术领域。该方法先将CDI溶液滴加到胶乳微球溶液，震荡混匀，得到活化的胶乳微球；向活化的胶乳微球中加入偶联缓冲液调节pH；将抗体加入到调节pH后的溶液中，震荡混匀，得到偶联后的溶液；将牛血清白蛋白母液加入到偶联后的溶液中，震荡混匀，得到致敏胶乳。本发明还提供上述制备方法得到的致敏胶乳。本发明还提供一种含上述致敏胶乳的试剂盒。本发明的方法偶联效率高、成本低，得到的试剂盒性能优异。

技术领域

本发明属于医药试剂技术领域，具体涉及一种羧基微球偶联氨基的方法、致敏胶乳及试剂盒。

背景技术

体外诊断目前主要的方法有酶联免疫法、胶乳比浊法、化学发光法及分子诊断等方法。胶乳比浊法和化学发光法中涉及用到微球标记蛋白。微球标记蛋白(抗原或抗体或亲和素)的方法主要是吸附法和共价偶联法，目的是将待测物质相对应的抗体或抗原包被在微球上，通过待测物质与包被了相应抗原抗体的微球反应后的特性进行检测提高试验的敏感性。共价偶联法中常用的微球表面偶联有功能基团-羧基。

胶乳增强免疫比法(Latex particle-enhanced turbidimetric immunoassay,LETIA)是一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。其原理通过在高分子乳胶微球表面交联的单克隆抗体，当抗原与交联有抗体的微球结合后，能够在短时间内迅速聚集在一起，改变反应溶液的吸光度。而且，反应液吸光度的改变与被测抗原的浓度在一定范围内具有线性关系，可用来反映被测抗原的浓度。

LETIA法需要采用物理或者化学的方法将抗体偶联在微球表面，物理吸附法，是由于蛋白质和胶乳颗粒之间是以静电相互作用或者是疏水相互作用结合在一起的，是一种弱的作用力，所以蛋白很容易从胶乳微球上解离下来，造成试剂的不稳定、偶联效率低，在实际应用上受到一定的限制。化学偶联法，是通过胶乳微球表面的功能基团与免疫活性分子上的氨基以共价键的形式结合在一起，增强了试剂的稳定性和抗干扰能力。所以目前国内的研发，大部分采用化学偶联法；目前羧基微球偶联氨基的通用方法有两种：一是以碳二亚胺(EDC)为交联剂的一步法，二是以碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为交联剂的两步法。

在实际应用中EDC对pH值敏感，活化羧基的最适pH值在3.5-4.5，但是活化羧基后形成的中间产物与氨基偶联的最适pH在4.5-7.5，在实际应用过程中，这种操作比较繁琐，影响反应效率。另外EDC可与磷酸基团发生反应，所以在EDC参与的反应过程中不能使用磷酸缓冲液，但是磷酸缓冲液是在本领域内常用的、易配制且价廉的缓冲液。因此，现有技术中的一步法和二步法均由于使用EDC作为交联剂，导致反应条件受到诸多限制，操作条件的苛刻与操作步骤的繁琐进一步导致了目前的羧基微球偶联氨基方法成本高、偶联效率低。

N,N’-羰基二咪唑(CDI)是一种在溶液或者固相肽合成中活化羧酸的试剂，但至今未见其应用于羧基微球标记蛋白领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羧基微球偶联氨基的方法、致敏胶乳及试剂盒，该方法偶联效率高、成本低。

本发明首先提供一种羧基微球偶联氨基的方法，包括以下步骤：

步骤一：将CDI溶液滴加到胶乳微球溶液，震荡混匀，10-37℃震荡活化20-30min，震荡速度为50-200rpm/min，得到活化的胶乳微球；

步骤二：向步骤一的活化的胶乳微球中加入偶联缓冲液调节pH至7-9；

步骤三：将抗体加入到调节pH后的溶液中，震荡混匀，10-37℃震荡偶联2-3h，震荡速度为50-200rpm/min，得到偶联后的溶液；

步骤四：将牛血清白蛋白母液加入到偶联后的溶液中，震荡混匀，10-37℃震荡封闭1-2h，震荡速度为50-200rpm/min，然后将溶液清洗换液，得到致敏胶乳。