[发明专利]歧化比活和AA-2G产量提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体

说明书

本发明公开了歧化比活和AA‑2G产量提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于PaenibacillusmaceransJFB05‑01的环糊精葡萄糖基转移酶进行突变，得到的突变体歧化比活性显著提高，其中，突变体Y195F/Y260F生产AA‑2G产量为22g/L，较野生酶提高46.7％，提高转化率，降低生产成本，适于工业化生产。

技术领域

本发明涉及歧化比活和AA-2G产量提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

维生素C(Vitamin C，VC)，又称L-抗坏血酸(L-AscorbicAcid，L-AA)，是一种水溶性维生素，在保持和促进人体健康以及动物生长方面具有重要的作用。但由于本身化学结构极不稳定，限制了应用范围。研究发现，VC糖基衍生物2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)具有安全、稳定性强和在体内易降解产生L-AA等优点，能更好地为人体和动物吸收和利用，因而更具优势。

目前，AA-2G主要通过糖基转移酶生物催化生成，其中环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)是最常用的催化酶。现有技术针对环糊精葡萄糖基转移酶的基因改造和高效表达研究较多，但是实现环糊精葡萄糖基转移酶在工业化生产中仍存在很大的问题，例如酶的歧化活性较低，酶催化制备AA-2G的转化率低等。CGTase具有以分子间转糖基反应制备特定产物的优良应用性能，其受体分子具有广谱性，但针对不同受体，获得的转化率差异很大，通常以糖类分子作为天然受体分子——葡萄糖或麦芽糖等，其转化率明显高于非糖类分子，如本研究中的VC。在以麦芽糊精为糖基供体制备AA-2G的反应体系中，存在较多的葡萄糖和麦芽糖，而与VC相比，小分子糖具有做受体的优势，从而与VC竞争，导致转化率低。通过对CGTase受体底物结合亚位点进行改造，提高CGTase的歧化活性以及对VC做受体的底物特异性，从而提高AA-2G的转化率，降低酶的成本，将推动L-AA糖基衍生物相关行业的快速发展。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明通过对来源于PaenibacillusmaceransJFB05-01的环糊精葡萄糖基转移酶进行改造，以获得歧化活力提高的突变体，将突变体应用于AA-2G的生产，以提高AA-2G的产量。

本发明提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，所述突变体是以来源于PaenibacillusmaceransJFB05-01的环糊精葡萄糖基转移酶为亲本，将亲本的第195位、260位的一个或两个位点进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于亲本，将亲本第195位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，并命名为Y195F，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于亲本，将亲本第260位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，并命名为Y260F，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于亲本，将亲本第195位和260位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，并命名为Y195F/Y260F，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供一种编码所述突变体Y195F的基因。

本发明提供一种编码所述突变体Y260F的基因。

本发明提供一种编码所述突变体Y195F/Y260F的基因。

本发明提供一种携带编码所述突变体的基因的重组表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组表达载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列中的任意一种。