[发明专利]一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合及其应用

权利要求书

1.一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合，其特征在于，包括正向引物Ts-RPA-F、反向引物Ts-RPA-R、探针Ts-RPA-P；

所述正向引物Ts-RPA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述反向引物Ts-RPA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述探针Ts-RPA-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述反向引物Ts-RPA-R核苷酸序列的5’端标记有生物素；探针Ts-RPA-P核苷酸序列的5’端标记有荧光素，距离5’端至少31bp处的碱基进行脱碱基位点修饰，3’端修饰有阻断聚合酶扩增的基团。

3.如权利要求1或2所述的引物和探针组合在制备检测柑橘半穿刺线虫的试剂或试剂盒中的应用。

4.一种基于RPA技术检测柑橘半穿刺线虫的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物和探针组合，以及RPA冻干酶粉、Rehydration Buffer、MgAc、ddH₂O、检测缓冲液、侧流层析试纸条中的一种或几种。

5.一种基于RPA技术检测柑橘半穿刺线虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)以所述待测样品的DNA为模板，利用如权利要求1或2所述的引物和探针组合或如权利要求4所述的试剂盒进行RPA扩增；

(3)根据步骤(2)中RPA扩增的结果判定所述待测样品中是否含有柑橘半穿刺线虫。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RPA扩增的反应体系为：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RPA扩增的反应条件为：25～45℃反应5～60min。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中利用如权利要求4所述的试剂盒进行RPA扩增，步骤(3)为：将扩增产物与检测缓冲液混匀制备混合液，将侧流层析试纸条上样区置于混合液中，室温放置2～6min后观察结果；若侧流层析试纸条的质控线和检测线均出现条带时，检测结果为阳性，表明待测样品中含有柑橘半穿刺线虫；若试纸条上仅质控线出现条带时，则检测结果为阴性，表明待测样品中不含有柑橘半穿刺线虫；若试纸条上仅检测线出现条带或不出现任何条带，表明检测结果为无效。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样品为线虫样品、植物根组织样品或土壤样品中的一种或几种。