[发明专利]高效催化L-苏氨酸合成2,5-DMP的质粒及其构建与应用

说明书

本发明公开了一种高效催化L‑苏氨酸合成2,5‑DMP的质粒及其构建与应用，属于基因工程技术领域。本发明构建了包含不同微生物来源L‑苏氨酸脱氢酶(TDH)的重组pRSFDuet‑tdh_X质粒，以筛选出最高活性的TDH。然后，引入来源于Lactococcus cremoris的NADH氧化酶(NoxE)，并筛选出TDH和NoxE在pRSF‑Duet1质粒中的最佳构建方式。最终得到高效催化L‑苏氨酸合成2,5‑二甲基吡嗪的质粒pRSFDuet‑tdh_EcnoxE_Lc。将该质粒转入大肠杆菌BL21中进行全细胞转化实验，在含有5g/L L‑苏氨酸的转化体系中于37℃、200r/min孵化24h，可积累605.1±56.4mg/L的2,5‑DMP。此发明通过筛选不同来源的TDH酶和优化不同基因共表达方式，从而获得了一种能高效催化L‑苏氨酸合成2,5‑二甲基吡嗪的质粒，为构建2,5‑二甲基吡嗪高效催化质粒提供了新的思路。

技术领域

本发明涉及一种高效催化L-苏氨酸合成2,5-DMP的质粒及其构建与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

2,5-二甲基吡嗪(2,5-DMP)是一种重要的香味化合物和药物中间体，呈刺鼻的炒花生香气和巧克力、奶油气味。其存在于咖啡、花生等50多种天然食品中。作为食品香料时，只添加1-2ppm，就可起到明显的增香作用，是国标GB2760-86规定为允许使用的香精。同时，2,5-DMP还是合成第二代磺脲类降血糖药格列吡嗪、新一代长效降血脂药阿昔莫司(Acipimox)u以及治疗结核病的有效药物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯(PAE)等一系列药物的原料或药物中间体。其本身也具有潜在的抑制子宫收缩效果，小鼠实验研究表明其可能可以用于防止宫缩导致的子宫破裂和胎儿窒息。相比常用β2受体兴奋剂和钙拮抗剂类药物所可能导致的严重副作用如低血压和心脏加速或延缓，2,5-DMP将是很好的潜在替代物。因此，摸索新的2,5-DMP经济高效的生产方法无疑是非常重要的。

2,5-DMP的生产方法主要有化学合成法，添加前体物质发酵法，直接发酵法等。目前化学合成法仍是2,5-DMP的主要生产方法，但化学合成过程中所用的原料和催化剂以及形成的副产物具有一定的毒性，会对人和环境造成一定的危害。为了获得食品安全和环境友好的2,5-DMP，人们开始越来越关注于2,5-DMP生物发酵的研究。1997年，Besson等人成功利用一株从发酵大豆中分离的天然B.subtilis以大豆固体培养基发酵生产2,5-DMP。1999年，2,5-DMP源自L-苏氨酸的合成途径被提出。2019年，江南大学的徐岩团队利用同位素标记底物进行全细胞催化实验，首次阐明了2,5-DMP的合成机制。自此，通过基因工程等手段理性选育2,5-DMP高产菌株成为可能。

文献报道明确揭示出了2,5-DMP在枯草芽孢杆菌中的合成机制：L-苏氨酸首先在苏氨酸脱氢酶的催化作用下生成2-氨基-3-酮丁酸，再经自发脱羧反应，形成相对稳定的α-氨基丙酮；每两个α-氨基丙酮经过自发脱水缩合成环状的3,6-二氢-2,5-二甲基吡嗪，进而被氧化脱氢，生成2,5-DMP。其中，后三步都是可以自发进行的，而L-苏氨酸脱氢酶(Threonine dehydrogenase,TDH,编码基因tdh)则是整个生化反应的关键限速酶，因而筛选一种高活性的苏氨酸脱氢酶对于2,5-DMP的生物合成极为重要。